[发明专利]一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法及其用途

摘要

本发明涉及氨苄青霉素特异结合物的筛选方法及其应用，属于生物技术领域，该特异结合物是由核糖体展示anticalin库中筛选出来的并进行了可溶性表达。本发明还涉及应用核糖体展示技术筛选氨苄青霉素特异结合物的方法。本发明筛选出的氨苄青霉素特异结合物可以应用于青霉素非法添加及滥用检测与研制快速检测青霉素残留的免疫速测试剂盒的用途，为以后该物质的检测与研究奠定了基础。

主权项

一种氨苄青霉素特异结合物的筛选方法，主要由以下步骤组成：(1)核糖体展示anticalin模拟抗体库的构建选择胆汁三烯结合蛋白(bilin binding protein，bbp)作为突变库的模板，根据bbp序列及结构，设计随机突变位点，，随机核酸编码区设计成NNK(N为G、C、A、T；K为G和T)，Acticalin抗体库构建由PCR完成，以合成的BBP基因序列为模板，由设计的引物进行重叠引物延伸PCR扩增来合成Acticalin模拟抗体库片段，约522bp，再通过PCR方法添加启动子、间隔序列、茎环结构等核糖体展示所需要的元件，最终构建成功的核糖体展示anticalin模拟抗体库转录后的RNA分子包括一个5’‑loop和3’‑loop茎环结构，一个核糖体结合位点，突变的bbp库，C末端间隔序列等，全长约950bp；(2)氨苄青霉素特异结合物的筛选将构建的核糖体展示单链抗体文库进行体外转录翻译后，用Amp‑BSA和Amp‑PLL(多聚赖氨酸，polylysine，PLL)作为抗原固相交替筛选氨苄青霉素的特异结合物，通过改变Mg2+浓度将筛选得到的特异结合物‑核糖体‑mRNA三联体解离，得到相应的mRNA，经过RT‑PCR得到筛选后的DNA文库；然后重复体外转录‑体外翻译‑亲和筛选‑RT‑PCR扩增过程，得到反复筛选几轮的模拟抗体DNA文库；经过七轮核糖体展示筛选后，抗体文库中抗原阳性的抗体得以富集；(3)anticalin‑amp的可溶性功能表达将七轮筛选后对模拟抗体文库进行序列鉴定，随机挑选20个克隆子中有5株序列相同，将该基因与pTIG‑TRX连接成表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，经SDS‑PAGE和WesternBlot鉴定，在20KDa处有目的蛋白条带，与理论蛋白大小一致，确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中；(4)anticalin‑amp的纯化与鉴定利用Anti‑His tag亲和层析柱对表达的anticalin‑amp进行了纯化，使目的条带得到了明显的浓缩和分离，直接ELISA分析其结合活性，间接竞争ELISA分析其竞争结合活性。