[发明专利]用于多重连接扩增技术的探针制备方法

摘要

本发明公开了可用于多重连接扩增技术（MLPA）的长探针的制备方法，包括以下步骤：1）选择与待测目标序列无关的载体作为模板，并根据目标核苷酸序列和目标探针长度设计引物；2）人工合成引物；3）PCR扩增；4）PCR产物纯化回收；5）使用Lambda外切酶对PCR产物进行消化；6）回收单链DNA。本发明所述MLPA探针制备方法成本低廉，只需要PCR仪即可完成扩增、酶切等全部操作，酶消化后使用专门的ssDNA回收试剂盒进行回收，排除了没有消化完全的dsDNA和核苷酸，提高MLPA实验时的杂交效率，通过充分的Lambda外切酶消化，可最大程度的将dsDNA变为ssDNA，从而提高了探针制备效率。

主权项

用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下步骤：1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GP1（5’端带荧光基团修饰）和GP2，用于最后的PCR扩增检测，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针RPO‑N，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成；2)确定一段与探针及通用引物无关的核苷酸序列S，并用于设计一对扩增左端长探针的引物，分别为GPL和LPO‑N’，其中GPL是由GP1的序列与S序列的前18bp左右的序列组成，LPO‑N’由目的左探针序列的反向互补序列与S序列中的18bp左右反向互补的序列组成，并且其5’端要带上磷酸化修饰；3)用GPL和LPN以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列；4）纯化回收PCR产物；5）采用核酸Lamda外切酶对以上双链核苷酸序列进行消化，去除5’磷酸化标记的那条单链DNA；6）采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到左端长探针。