[发明专利]EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法

摘要

EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。是要解决目前重组杆状病毒质粒载体转导效率低、表达效率较工业生产要求差距大、表达时间短等问题。方法；一、PCR扩增EF1α基因；二、构建质粒pT-EF1α；三、构建质粒pWK；四、PCR扩增L-ITR基因，构建pWK-L-ITR；五、PCR扩增R-ITR基因，构建pWK-ITR；六、PCR扩增EGFP基因，构建EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK-ITR-EGFP。本发明通过添加VSV-GED、WPRE和ITR元件，增强了外源基因的表达效率，增强了病毒的转导效率，延长了表达时间。

主权项

EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于EGFP基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行：一、以质粒peglk为模板，WK2和WK3为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EF1α基因；二、将EF1α基因与pMD18‑T载体连接，得到质粒pT‑EF1α；三、分别对质粒pT‑EF1α和pFB‑VSVGED‑WPRE进行双酶切，将酶切后获得的目的片段EF1α和酶切后的pFB‑VSVGED‑WPRE连接，得到质粒pWK；四、以pAAV‑LacZ为模板，La和Lb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得L‑ITR基因，分别对L‑ITR基因和pWK进行单酶切，将酶切后的L‑ITR和pWK连接，连接产物即为pWK‑L‑ITR；五、以pAAV‑LacZ为模板，Ra和Rb为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得R‑ITR基因，分别对R‑ITR基因和pWK‑L‑ITR进行单酶切，将酶切后的R‑ITR和pWK‑L‑ITR连接，连接产物即为pWK‑ITR；六、以pEGFP‑C3为模板，pEGFP‑f和pEGFP‑r为引物进行PCR扩增，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得EGFP基因，分别对EGFP基因和pWK‑ITR进行双酶切，将酶切后的EGFP和pWK‑ITR连接，连接产物即为EGFP基因重组杆状病毒表达载体pWK‑ITR‑EGFP；其中步骤一中PCR扩增所用引物WK2序列为5’‑TGCTCTAGACGTGAGGCTCCGGTGCCC‑3’，引物WK3序列为5’‑CCGGAATTCCGGCGGCCGCTGATCGATTCACGACACCTGAAATGGAAGAAAAAA‑3’；步骤四中PCR扩增所用引物La序列为5’‑TGCTCTAGATTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT‑3’，引物Lb序列为5’‑TGCTCTAGAGTAATTGATTACTATTAATAACTAGTACGCGTGCG‑3’；步骤五中PCR扩增所用引物Ra序列为5’‑ATACGGTCCGATGTCTGGATCTCCGGACACGTG‑3’，引物Rb序列为5’‑ATACGGTCCGGGAGAAAATACCGCATCAGGCG‑3’；步骤六中PCR扩增所用引物pEGFP‑f序列为5’‑ACTGAATTCGCCACCATGGTGAGCAAGG‑3’，引物pEGFP‑r序列为5’‑TCAGTCGACTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC‑3’。