[发明专利]胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建

摘要

本发明涉及一种生物技术，具体是胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。它是按如下步序操作：(1)质粒的转化；(2)质粒的消化纯化；(3)目的基因和载体的克隆；(4)重组质粒的包装；(5)重组质粒的鉴定；(6)病毒滴度测定；(7)干细胞培养；(8)病毒感染干细胞；(9)转基因干细胞鉴定；(10)转基因干细胞的目的蛋白含量测定；(11)转基因干细胞生物活性检测。本发明构建的转基因胚胎神经干细胞不仅对多巴胺能神经元具有很强的促存活作用，而且还保留了原来的神经干细胞的特性。本发明不仅对运动神经元损伤性疾病，也对神经元变性性疾病的具有很好的治疗作用。

主权项

胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：它按如下步序进行：(1)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体pLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。(2)限制性内切酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收DNA。(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒pLNCX2‑GDNF转染包装细胞pT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67‑GDNF)。(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，阳性克隆pT67‑GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。(6)病毒滴度的测定，将pT67‑GDNF细胞培养上清液收集，加入小鼠成纤维细胞培养液，并筛选抗性克隆。(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后，用DMEM‑F12培养液培养传代。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，将pT67‑GDNF细胞上清液感染NSCs，并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。(9)Western印迹鉴定GDNF‑NSCs，抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞GDNF‑NSCs蛋白，行Western印迹并免疫组化鉴定。(10)ELISA测定GDNF‑NSCs的GDNF含量，将GDNF‑NSCs细胞上清液收集，以ELISA法测定GDNF的含量。(11)转基因干细胞GDNF‑NSCs生物活性检测，取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后，加入NSCs‑GDNF细胞培养上清液检测GDNF的生物活性。