[发明专利]一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法

摘要

本发明公开了一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，该方法采用未成熟合子胚诱导出胚性愈伤组织，经过维持与增殖、成熟阶段获得体细胞胚，再经过萌发阶段获得再生植株，最后进行再生植株的移栽。本发明的黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，繁殖率高，在成熟培养基上培养70d后，平均每培养皿成熟的体细胞胚达144~216个，体细胞胚萌发率为63.8%，植株转化率为43.5%。这样每年可以获得大量的体胚苗，为黑松体细胞胚发生与再生植株工厂化奠定基础，解决当前造林种苗紧缺的问题，具有很好的实用性。

主权项

一种黑松体细胞胚胎发生和植株再生方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在诱导培养基上，温度23℃，暗培养，直至将无菌的未成熟黑松合子胚诱导出胚性愈伤组织，诱导培养基采用DCR基本培养基，在其中添加1~4 mg/L 2,4‑D、0.5~2 mg/L 6‑BA、30g/L麦芽糖、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉；（2）采用DCR基本培养基，在其中附加2mg/L 2,4‑D、1mg/L 6‑BA、15g/L麦芽糖，1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，对胚性愈伤组织进行维持与增殖，温度23℃，暗培养，每2~3周继代一次；（3）先采用DCR基本培养基，在其中附加1.2g/L活性炭、15g/L麦芽糖、1g/L肌醇、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、250mg/L MES和6g/L琼脂粉，23℃，暗培养7~10d，对步骤（2）的胚性愈伤组织进行预处理；再采用DCR基本培养基，在其中附加10~30mg/L脱落酸、0~50g/L 聚乙二醇（6000）、60g/L麦芽糖、250mg/L MES、450mg/L谷氨酰胺、500mg/L水解酪蛋白、8g/L肌醇、8g/L琼脂粉和2g/L AC，温度23℃，暗培养65~75d，对预处理后的胚性愈伤组织进行体细胞胚的成熟培养；（4）先采用DCR基本培养基，在其中附加2g/L AC、8g/L琼脂粉和20g/L麦芽糖，温度23℃，先暗培养5~7d，再光照度2000lx及16/8小时的光/暗培养13~15d，对步骤（3）的成熟体细胞胚进行萌发；然后采用WPM基本培养基，在其中附加1.0mg/L IBA、0.2mg/L NAA、15g/L蔗糖、0.1g/L肌醇和6g/L琼脂粉，温度23℃，光照度2000lx及16/8小时的光/暗培养1个月，进行体细胞胚植株再生；（5）采用WPM基本培养基，在其中附加珍珠岩、0.1g/L肌醇和15g/L蔗糖，温度23℃，光照度2000lx及16/8h的光/暗培养，对再生植株进行壮苗1个月以上；（6）采用体积比为1：1：1珍珠岩、土和河沙为基质，对再生植株进行移栽。