[发明专利]一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法

摘要

本发明提供一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，经过对豚鼠进行EBV病毒接种；豚鼠外周血淋巴细胞分离；RNA提取；RT-PCR逆转录；Nested-PCR扩增；对目的DNA片段进行回收、纯化后，将DNA连接在pGEM-T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，送至测序公司测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型，以便对EBV病毒包括病原学、免疫学、发病机理等进行研究，以在相关药物的筛选、疫苗评价等应用方面起到重要作用。

主权项

一种EBV病毒豚鼠动物模型的建立方法，其特征在于经过下列步骤：A、将0.1ml病毒滴度为1.0×106~1.0×107的EBV病毒液经豚鼠鼻腔滴鼻，进行EBV病毒接种；B、接种后1周，取5ml豚鼠血液与5ml RPMI 1640培养基混匀，加于10ml豚鼠淋巴细胞分离液之上，2000r/min离心20min，使细胞分为四层；C、收集第二层细胞并放入5ml含RPMI 1640培养基中，混匀，1500r/min离心20min，分离出的沉淀用RPMI 1640培养基反复重悬洗2次后收集；D、在步骤C收集的淋巴细胞上加入1ml TRIZOL，常温静置1h，加入0.2ml氯仿，混合至乳白色无分相，室温静置5min，4℃ 13500r/min离心15min，取上层液并加入等体积异丙醇，混匀，静置10min，4℃ 13500r/min离心10min，去上清，向沉淀物中加入1ml ‑20℃预冷的质量浓度为75%的乙醇，清洗，4℃，13500r/min离心5min，去上清，室温放置干燥后用RNase free dH2O溶解，得到总RNA；E、采用20μL反应体系对步骤D得到的总RNA进行RT逆转录成cDNA；F、以cDNA为模板用Nested‑PCR扩增，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外观察并摄片；G、回收步骤F的目的DNA片段，经纯化后，将目的DNA片段连接在pGEM‑T载体上，经转化、质粒提取、酶切鉴定后，测序，建立起EBV病毒豚鼠动物模型。