[发明专利]青霉菌细胞内外蛋白质组的提取

摘要

本发明公开了一种青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，包括如下步骤：(1)细胞内蛋白的提取：在LB培养基中接种青霉菌，培养，选8～12个时间点，收集细胞，每份细胞在液氮中研磨成细胞粉末；悬浮于裂解缓冲液中，加入DNase I和RNaseA的水溶液，加入苯甲基磺酰化氟-异丙醇溶液，超声，离心收集上清液，与丙酮混合，放置；离心，将沉淀物冻干，得到细胞内蛋白组，测定蛋白含量；(2)细胞外蛋白的提取：利用本发明的方法可以方便有效的提取蛋白，为鉴定不同工业发酵条件下蛋白变化奠定了基础。

主权项

青霉菌细胞内外蛋白质组的提取，其特征是包括如下步骤：(1)细胞内蛋白的提取：在LB培养基中接种青霉菌，培养，从接种1～2h起至170～180h，选8～12个时间点，每个时间点收集1～3份细胞，每份细胞分别用冰浴的0.5～5mM苯甲基磺酰化氟‑超纯水溶液洗涤3～5次；‑10～4℃收集洗涤后的细胞，在液氮中研磨成细胞粉末；取0.1～1g所述细胞粉末悬浮于裂解缓冲液中，再加入10～15μl DNase I和RNaseA的水溶液，冰浴放置15～30min，加入10～15μl浓度为0.8～1.2mM苯甲基磺酰化氟‑异丙醇溶液，超声10～15秒/次，共3～5次，以10,000～100,000xg的转速离心10～60min后，收集上清液，在‑15～‑30℃的条件下与1～10倍于上清液体积的冰浴的丙酮混合，放置2～10h；再以10,000～100,000xg的转速离心10～60min，将沉淀物冻干，得到细胞内蛋白组，测定蛋白含量；所述裂解缓冲液的配制为：5～8mol尿素、1～3mol硫脲、10～50mg 3‑((3‑胆汁氨丙基)二甲基胺)‑1‑丙磺酸、20～50mmol Tris碱，加水定容至1L；所述DNase I和RNaseA的水溶液的配制为：8～15mg DNaseI，2～4mg RNaseA、30～60mmol MgCl2、0.1～1mol Tris‑HCl，调pH为7.0，加水定容至1L；(2)细胞外蛋白的提取：在LB培养基中接种青霉菌，培养，在生长周期的OD540值分别在1～10之间取3‑5份1L的发酵液，在1～10℃，10,000～100,000xg离心10～60min，上清液通过0.1～1μm孔径过滤，滤液加入冰浴的三氯乙酸至三氯乙酸终浓度为10～20mg/100ml，进行沉淀，用体积浓度为80％‑90％的丙酮水溶液洗涤沉淀4‑5次，得到细胞外蛋白组，测定蛋白含量。