[发明专利]传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法

摘要

本发明公开一种传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：提取传染性造血器官坏死病毒RNA；RT-PCR反应；目标基因的纯化；目的片段的连接转化；回收质粒；体外转录；转录后RNA纯化处理；酚氯仿抽提。本发明不仅制备过程省时省力，而且所制备的传染性造血器官坏死病毒核酸标准样品稳定性高、均匀性好，可以为传染性造血器官坏死病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。

主权项

一种传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：a. 传染性造血器官坏死病毒RNA的提取在离心管中加入Trizol裂解液600μl，传染性造血器官坏死病毒细胞培养物200μl，加入氯仿200μl震荡混匀，10 000 g离心15min；吸取上清液500 μl加入到500μl异丙醇中，反复颠倒混匀，10 000 g离心15min；弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入75%的酒精600μl，颠倒洗涤，10 000 g离心10min；弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4 000g离心10sec，吸干管底的液体，室温干燥3 min；加入11.5 μl的DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁内的RNA，2 000g离心5sec，4℃保存，做为模板备用；b. RT‑PCR反应 b‑1．反转录体系5×M‑MLV Buffer 4µl，dNTPs（各2.5mmol/L） 2µl，M‑MLV（5U/µl）1µl，RNA酶抑制剂0.5µl，反转录引物（20pmol/µL）1µl，a步骤所得RNA模板11.5µl；所述反转录游引物是5’‑TCAAGGGGGGAGTCCTCGA‑3’，总反应体系为20µl；b‑2．反转录条件42℃水浴1h~2h；b‑3．PCR扩增反应体系10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5µl，dNTPs（各2.5mmol/L） 0.5µl，Taq DNA聚合酶（5U/µl）1µl，上游引物、下游引物（20pmol/µL）各1µL，b‑2的反转录产物0.5µl，用无菌水补充至25µl；所述上游引物是5’‑TCAAGGGGGGAGTCCTCGA‑3’；所述下游引物是5’‑CACCGTACTTTGCTGCTAC‑3’；b‑4. PCR扩增条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃ 5min；c. 目标基因的纯化采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒，回收目标分子DNA片段；d. 目的片段的连接转化d‑1连接体系c步骤所得到的纯化的目的片段4µl，2×Rapid ligation buffer 5µl，PGEM‑T载体0.5µl，T4 DNA Ligase 0.5µl，室温连接1h；d‑2 转化将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中，混匀，冰浴20min，42℃热应激1min，冰浴2min，加入800µl SOC培养基，150g摇菌1.5h，1 000g离心10min，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200µl，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37℃倒置培养12h~16h；d‑3 阳性克隆的筛选挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b‑3、b‑4；e. 回收质粒；f. 体外转录将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为：10×H Buffer 5µl，SalI 1µl，质粒 10µl，双蒸水 34µl；37℃2h，用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录反应体系为：10× T7 RNA polymerase buffer 5µl，DTT 5µl，NTP 10µl，Rnasin 1µl，线性化质粒5µl，T7 RNApolymerase 1µl，DEPC处理水28µl；37℃2h，然后再加入10U DnaseI 2µl，37℃，30min；g. 转录后RNA 纯化处理 对转录的 RNA 进行 DNase 处理，反应体系及条件如下：所述f步骤的转录反应液20ul、RNase free DNaseⅠ（5u/ul）4 ul、Total 24ul，37℃ 1h； h. 酚氯仿抽提  对所述g步骤经DNase处理的反应液进行酚氯仿抽提，最终用 RNase‑free dH2O补足至 100 ul。