[发明专利]水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法

摘要

本发明提供了水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，能够有效地分离几乎每个TAL效应物家族基因的重复区，并对其进行精确测序、组装，为TAL效应物的功能性研究及应用提供了必不可少的支持。

主权项

一种水稻白叶枯病菌转录激活因子样效应物基因的测序方法，包括：(1)将水稻白叶枯病菌BAI3R的基因组DNA和含有avrBs3/pthA家族基因的BAI3R cosmid文库质粒分别用限制性内切酶BamHI完全消化，所得片段用0.8％琼脂糖凝胶分别电泳分离；以avrBs3/pthA家族基因avrXa7中的第122至842碱基片段为探针，对分离得到的DNA片段进行Southern杂交，确定cosmid文库质粒中携带的avrBs3/pthA家族基因与基因组中avrBs3/pthA家族基因的对应情况，同时估计该avrBs3/pthA家族基因含有重复单元数目n；(2)将cosmid文库质粒中与Southern杂交中条带对应的BamHI条带切下，并回收DNA片段；将该BamHI条带中DNA片段克隆到用BamHI消化过的载体pWEB‑TNC中，得到pWEB‑tal质粒；(3)将pWEB‑tal与EZ‑Tn5TM Transposase混合，其中pWEB‑talC 2μg，EZ‑Tn5TM Transposase 1U，10X反应缓冲液1μl，37℃下反应两个小时；反应结束时加入1μl反应中止液，70℃下温浴10分钟以中止反应；(4)取1/10上述反应液，用化学转化方法转化到大肠杆菌DH5α菌株中，并筛选其中缺乏氯霉素抗性且有氨苄青霉素抗性的克隆；(5)提取上述克隆的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全消化，并用1％琼脂糖凝胶分析酶切图谱；有单一或两个外源片段的克隆均可用于测序分析；(6)选取等于或超过重复单元数目n个数的克隆，提取质粒，用位于pWEB‑TNC上靠近复制起始位点的反向引物进行测序，对每个克隆测一个反应；(7)将含有两个外援片段的克隆的测序结果进行反向互补转化，然后与含有单一外源片段克隆的测序结果综合，依据序列间的相似性将测序结果排序、组装，最终得到BamHI片段的完整序列；(8)以BamHI片段序列为模板，在其5′端设计反向引物，在其3′端设计正向引物，以对应cosmid为模板对avrBs3/pthA家族基因的5′端、3′端进行测序，所得结果和BamHI片段序列拼合，最终的到avrBs3/pthA家族基因的 全长序列。