[发明专利]基于荧光偏振的EGFR基因启动子甲基化状态均相检测法

摘要

本发明涉及一种基于荧光偏振的EGFR基因启动子甲基化状态均相检测方法。本发明克服了现有技术存在的成本高、操作步骤繁琐、易发生污染和影响检测结果准确性问题，本方法步骤简单，操作简单；闭管中一步完成，不易污染。成本低，不需任何专用试剂及荧光淬灭或微沟槽结合剂。通过应用单端标记的甲基化特异的探针，导致荧光偏振值的改变，检测靶区域甲基化，检测结果更客观准确。结果分析简单，结果判断时仅需数字比较，易标准化、自动化，应用范围广，可用于检测临床血液或组织标本。

主权项

一种用于测定样品中EGFR基因启动子甲基化状态的均相检测法，所述均相检测法包括下列步骤：（1）从样品中得到提取物：使用一种试剂或试剂盒从待测样品中提取基因组DNA，再用另一种试剂或试剂盒处理基因组DNA并纯化，得到纯化的提取物；（2）扩增结合：将上述纯化的提取物加入反应试剂进行扩增结合，所述反应试剂包括10倍的PCR缓冲液,浓度各为 2.0～2.5mmol/L的dNTP，2.0～3.5mmol/L的MgCl，1‑5U/μl的TaqDNA聚合酶，浓度为0.5‑2.0μmol/L的EGFR基因的启动子靶CpG岛区甲基化和非甲基化上游引物、下游引物，以及浓度为0.05‑0.2μmol/L的靶基因的5’端带荧光标记的探针，所述反应条件是：94‑95℃变性4‑10min后，95℃孵育5‑40秒，55‑65℃孵育15‑60秒，72℃孵育10‑60秒，35‑45个循环，最后室温15‑30℃孵育；（3）：检测：检测反应溶液的荧光偏振FP值，SPSS软件计算FP均值(means)和标准差(S.D.)，t检验统计阴性、阳性对照反应终液FP值分布，阳性临界值Cut‑off=阴性对照FP均值(means)‑阴性对照FP标准差(S.D.)，阴性临界值Cut‑off=阴性对照FP均值(means)+阴性空白对照FP标准差(S.D.)，待测样品FP值与Cut‑off值比较即知靶区域CpG位点甲基化状态：待测样品FP值>阴性临界值 Cut‑off值，靶区域CpG位点为非甲基化状态,待测样品FP值＜阳性临界值Cut‑off值，靶区域CpG位点为甲基化状态,阳性临界值Cut‑off值＜待测样品FP值＜阴性临界值Cut‑off，则靶区域CpG位点甲基化状态无法判断，需重新检测。