[发明专利]一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法

摘要

本发明公开了一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步骤：(1)原料处理：将原料单环刺螠制成匀浆液；(2)酶解；(3)超滤；(4)糖胺聚糖的制备：①除蛋白质；②醇沉、洗涤；③阴离子交换柱层析；④凝胶过滤层析得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备。本发明的方法反应条件温和、制备过程绿色环保节能，产品附加值高；制备的糖胺聚糖和抗菌肽纯度高；可大量回收蛋白质，有利于单环刺螠的综合利用，所制备的糖胺聚糖具有明显的抗凝血、清除自由基的效果，制备的抗菌肽对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等具有明显的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽还可为海珍动物养殖业提供优良的免疫增强剂和新型抗菌药物。

主权项

一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征是包括如下步骤：(1)原料处理：将原料单环刺螠洗净后，匀浆，制成匀浆液；(2)酶解：向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，在43℃‑47℃水浴条件下酶解4‑6h，酶解液煮沸灭酶后，5000r‑8000r/min离心10min‑15min，得上清液；(3)超滤：将所述上清液通过相对分子质量1万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量1万以下和相对分子质量1万以上的两种组分的液体；(4)糖胺聚糖的制备①除蛋白质：将所述相对分子质量1万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的1/3‑1/4，先用HCl水溶液调pH至2.0，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7.0，离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为3％‑5％，离心除去蛋白质沉淀；②醇沉、洗涤：将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为70％‑80％，于4℃条件下静置20‑28小时，5000r‑8000r/min离心10min‑15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2‑4次，得粗提糖胺聚糖；③阴离子交换柱层析：将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为1％‑3％，加到阴离子交换柱中，先用pH＝5.0‑5.5乙酸‑乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0‑2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液浓缩至洗脱液体积的1/2‑1/4、透析、再浓缩至透析后液体积的1/3‑1/4；④凝胶过滤层析：将步骤③获得的浓缩液上样于SephadexG‑100凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/4‑1/6，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；(5)抗菌肽制备：将所述相对分子量1万以下组分的液体浓缩至该液体体积的1/2‑1/4，上样于SephadexG‑100凝胶过滤柱，用0.2mol/L pH＝7.0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/2‑1/3，浓缩液上样于SephadexG‑25凝胶过滤柱，0.2mol/L pH＝7.0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/4‑1/6，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。