[发明专利]山羊乳腺上皮细胞的建系方法

摘要

本发明公开了一种山羊乳腺上皮细胞建系方法。该方法在取材上选用了妊娠期山羊乳房组织；采用组织快法在普通细胞培养皿进行原代培养，将组织块干涸培养时间适当延长；干涸培养结束后立即添加适量乳腺上皮细胞培养液，后期半量换液，直至细胞铺满皿底；通过胰酶差速消化法纯化乳腺上皮细胞；使用高密度连续传代培养法建立起山羊乳腺上皮细胞系并冷冻保存。所述普通细胞培养皿未使用胶原覆盖；乳腺上皮细胞培养液中仅添了FBS、ITS、EGF。本发明具有简单、高效、低成本的建立山羊乳腺上皮细胞系的优点，为开展山羊乳腺发育、泌乳调控机制、乳腺生物反应器等研究提供大量极易获得的材料。

主权项

一种山羊乳腺上皮细胞的建系方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)山羊乳腺上皮细胞的分离(1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的DPBS溶液洗涤一遍；(2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成1mm3小块，用移液器吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持1cm2左右；(3)37℃、5％CO2、饱和湿度下将培养皿倒扣干涸培养6～12h，期间勿翻动；(4)上述(3)倒扣干涸培养结束后，添加乳腺上皮细胞培养液，于37℃、5％CO2、饱和湿度下将培养皿正置培养；(5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4～6ml，自接种组织块72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8～10ml；以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10％FBS+1％ITS+10ng/ml EGF；(二)山羊乳腺上皮细胞的纯化(6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80～90％汇合时，吸弃培养基，用DPBS洗涤2遍；(7)加入乳腺上皮细胞消化液于37℃、5％CO2、饱和湿度下消化；所述 乳腺上皮细胞消化液的成分包括0.02％EDTA和0.25％Trypsin；(8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽；(9)迅速再次加入上述消化液于37℃、5％CO2、饱和湿度下消化；(10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终止培养液终止消化；传代比例始终保持1∶2；所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/F12+10％FBS；(11)重复(7)～(11)步骤，直至成纤维细胞去除干净；(三)山羊乳腺上皮细胞的传代培养(12)纯化后的乳腺上皮细胞铺满皿底80～90％时，加入所述乳腺上皮细胞消化液进行消化，消化时间以大部分上皮细胞变圆脱落为止，用所述乳腺上皮细胞终止液终止消化并离心、弃上清，传代比例始终保持1∶2；(四)山羊乳腺上皮细胞冻存(13)纯化后的乳腺上皮细胞长至90％，使用所述乳腺上皮细胞消化液消化，至大部分细胞变圆即将脱落时，用所述乳腺上皮细胞终止液终止消化并离心、弃上清；(14)使用提前37℃预热的乳腺上皮细胞冻存液重悬(15)中离心、弃上清后的细胞沉淀，每6cm皿冻存2管，每管分取0.2～0.5ml，冻存管放入含有新鲜异丙醇的冻存盒，‑80℃过夜，第二天早上转入液氮灌。