[发明专利]b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法

摘要

本发明公开了一种b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤：Hib菌种一至四代传代培养，种子罐培养，发酵罐发酵培养，杀菌、取上清液和纯化。本发明的有益效果是：（1）培养Hib细菌达到较高的浓度，使Hib荚膜多糖的产量在传统方式的基础上提高了50%～100%，且生产出的荚膜多糖符合国家质量标准；（2）将发酵液中的核酸和蛋白等杂质含量控制在低水平，较低的蛋白含量减少了苯酚抽提去除杂质蛋白的次数，从而降低了后续纯化过程中的苯酚用量，减少了对环境的污染，也降低了生产成本；（3）多糖产量稳定，纯化后的精糖蛋白和内毒素等杂质含量都大大低于国家控制的标准。

主权项

b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，其特征在于：它包括以下步骤：（1）Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤：A、第一代培养：开启Hib菌种传代至5～10mlHib液体培养基，放入恒温摇床振荡培养16～20h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35～37℃、回旋频率为250～330rpm；B、第二代培养：将第一代培养所得的Hib菌种接种到10～20mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养6～8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35～37℃、回旋频率为250～330rpm；C、第三代培养：将第二代培养所得的Hib菌种接种到20～50mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养6～8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35～37℃、回旋频率为250～330rpm；D、第四代培养：将第三代培养所得的Hib菌种接种到500～1000mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养，直到培养基中菌浓度达到100～200亿/ml，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35～37℃、回旋频率为250～330rpm；（2）种子罐培养：将第四代培养所得的Hib菌种接种到种子罐中，恒温搅拌通气培养，直到菌浓度达到200～300亿/ml，其中，恒温搅拌通气培养的温度为35～37℃、搅拌频率为100～200rpm；（3）发酵罐培养：将在种子罐中培养所得的Hib菌种接种到发酵罐中，恒温搅拌通气培养，在此过程中向发酵罐中补加浓度为10%的葡萄糖溶液，至Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期，菌浓度达到300～400亿/ml时停止搅拌培养，其中，恒温搅拌通气培养的温度为35～37℃、搅拌频率为200～300rpm；（4）杀菌、取上清液：向发酵罐中加入甲醛溶液至甲醛终浓度为1～2%进行杀菌，待杀菌完成后，取发酵液上清液；（5）纯化：对上清液进行纯化处理，获得b型流感嗜血杆菌荚膜多糖成品。