[发明专利]一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法

摘要

一种分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法，属于微生物生态技术领域。本发明用巢式聚合酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）的方法半定量分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的多样性。采用珠磨法提取大曲或酒醅样品中总基因组DNA，巢式PCR两步扩增Bacillus特异性片段，DGGE电泳分析，利用标准菌株确定DNA条带相应的微生物种属，未知条带切胶回收后重新PCR、连接T载体并克隆、再次DGGE电泳，阳性克隆测序并在GenBank数据库中blast比对获取微生物信息，最后利用quantityone软件数字化处理DGGE图谱，根据条带亮度计算出不同Bacillus菌种在总Bacillus菌群中的比例。本发明具有简便、特异性强、重复性好的优点，为进一步探究Bacillus在白酒生产中的重要作用奠定了基础。

主权项

用变性梯度凝胶电泳定性并半定量分析白酒发酵体系中Bacillus群落结构的方法，其特征在于包括以下步骤：（a）选择实验的大曲或酒醅样品，对样品进行预处理，并用珠磨法提取样品中微生物的总基因组DNA；（b）选择Bacillus的16S rRNA V9区基因作为DGGE的靶基因设计两对引物，并在第二轮PCR的正向引物的5’端加上GC发夹结构；巢式PCR所用的第一轮Bacillus专一性引物为：p1‑F：5’‑CGATGCGTAGCCGACCTGAG‑3’，p1‑R：5’‑AAGGAGGTGATCCAGCCGCA‑3’；第二轮针对Bacillus 16S rDNA V9区的引物为：p2‑F：5’‑ATGGCTGTCGTCAGCT‑3’，p2‑R：5’‑CGCCCGCCGC GCGGCGGGCG GGGCGGGGGC ACGGGCGGTG TGTAC‑3’；（c）以步骤（a）中的基因组为模板进行PCR扩增；（d）将PCR产物在最适条件下进行DGGE电泳分析；（e）染色后与已知的Maker比对，确定具有相同电泳迁移率的DNA条带相应的种属，将未知的优势条带切胶回收；（f）回收的DNA条带重新PCR扩增、连接T载体，转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布于加有一定浓度Amp的LB平板，挑选阳性克隆子；（g）对阳性克隆子的菌落PCR产物，再次进行DGGE比对、验证；（h）将与回收DNA条带具有相同电泳迁移率的PCR产物进行测序，测序结果在GenBank数据库中blast比对分析；（i）采用quantity one软件将DGGE图谱条带亮度进行数字化处理，即将每条条带的亮度转化为峰面积，将所有条带的峰面积加和代表Bacillus菌群总数，某种Bacillus相应的DNA条带的峰面积在所有条带峰面积之中所占比重，即为这种Bacillus在总的Bacillus菌群中所占的比例。