[发明专利]肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗

摘要

本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157:H7多价fliC-hcpA-tir-eae重组菌及疫苗，属于生物制药领域。分别扩增出EHECO157:H7的H7鞭毛（fliC）基因、菌毛（hcpA）基因、转位紧密素受体（tir）基因和紧密素（eae）基因，依次串联，克隆入表达载体pColdⅠ中，获得重组质粒pCold-fliC-hcpA-tir-eae，在BL21（DE3）获得高效表达。经过高密度发酵和一系列的纯化程序获得高纯度的融合蛋白分子疫苗。该疫苗的制备工艺简捷、易于放大、重复性好，所获得目标蛋白纯度较高，动物试验证明可刺激机体在体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫方面产生高效的免疫应答，免疫预防保护和治疗作用。

主权项

肠出血性大肠杆菌O157:H7多价融合型重组菌，其构建方法为：根据GenBank中O157:H7 EDL933 的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分别设计引物，并分别在上下游引物两端加入酶切位点，在hcpA基因后和eae基因前分别加入长度为24个核苷酸的连接片段，引物序列如下：fliC‑P1：5‑ggggagctcactattaccaacaaa‑3                  Sac ⅠfliC‑P2：5‑ttactcgagggtcgttgcagaacc‑3                  Xhol ⅠhcpA‑P1：5‑gggctcgagtttacacttatcgaactgat‑3              Xhol ⅠhcpA‑P2：5‑tttgaattctttagcagcagctttagcagcagcgttggcgtcatc‑3  EcoRⅠtir‑P1： 5‑gatgaattcgagccggatagccca‑3                   EcoRⅠtir‑P2： 5‑ttagtcgacagcccccgatgaaac‑3                   Sal Ⅰeae‑P1：5‑ttagtcgacgctgctgctaaagctgctgctaaatttgatcaaacc‑3   Sal Ⅰeae‑P2：5‑ ggctctagattattctacacaaaccgc‑3                 Xba ⅠO157:H7过夜培养物，1mL/管，12000r离心2分钟，弃上清，收集菌体重悬于1/5体积双蒸水，煮10min，4℃12000r离心10分钟，吸取上清冻存‑20℃，用于PCR扩增用；扩增fliC片段的上下游引物分别加有SacⅠ和XholⅠ酶切位点，扩增eae片段的上下游引物分别加有SalⅠ和XbaⅠ酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃ 1分钟，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，30个循环，72℃再延伸10分钟；扩增hcpA片段的上下游分别引物加有XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点，扩增tir片段的上下游引物分别加有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，PCR反应条件均为：95℃预变性5分钟，94℃ 1分钟，56℃ 30秒，72℃ 30秒，30个循环，72℃再延伸6分钟；fliC‑P1和 fliC‑P2、hcpA‑P1和hcpA‑P2、tir‑P1和tir‑P2、eae‑P1和eae‑P2扩增片段长度分别为946bp、423bp、309bp和811bp； 将扩增的PCR产物用质量比1.2%的琼脂糖电泳，切胶称重，加入3倍体积DE‑A 缓冲液后65℃作用10分钟，待胶全部融化后，再加入DE‑A 缓冲液的0.5体积的DE‑B 缓冲液，颠倒混匀后，将融化的液体转移于微型柱子，并12000g离心1分钟，弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅰ500uL，12000g离心30秒，再弃液体，加入洗涤缓冲液Ⅱ750uL，12000g离心1分钟，弃液体，空管12000g离心1分钟，转移柱子于干净的1.5mL离心管中，并加入60uL 洗脱缓冲液，12000g离心1分钟，收集离心液，即为经过纯化的fliC、hcpA、tir和eae片段；将SacⅠ和XholⅠ酶切的fliC片段4uL与同样酶切的载体pColdⅠ片段4uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0uL，同时加入一个离心管，混匀后，4℃连接过夜，用于转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，用SacⅠ和XholⅠ双酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到 fliC片段大小的条带出现，获得pColdⅠ‑fliC重组质粒；用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切hcpA片段和pColdⅠ‑fliC重组质粒，胶回收后，pColdⅠ‑fliC取4.0uL，hcpA片段取2 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0ul，补水2 uL，一同加入eppendorf管，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到hcpA片段大小的条带出现，获得pColdⅠ‑fliC‑hcpA重组质粒；用EcoRⅠ和SalⅠ酶切tir片段和pColdⅠ‑fliC‑hcpA重组质粒，胶回收后，pColdⅠ‑fliC‑hcpA取2.0uL，tir片段取3.0 uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0uL，补水3 uL，一同加入离心管中，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到tir片段大小的条带出现，获得pColdⅠ‑fliC‑hcpA‑tir重组质粒；用SalⅠ和Xba Ⅰ酶切eae片段和pColdⅠ‑fliC‑hcpA‑tir重组质粒，胶回收后，pColdⅠ‑fliC‑hcpA‑tir和eae各取4.0uL，T4 DNA连接缓冲液和T4 DNA连接酶各1.0ul，一同加入管中，混匀后，4℃连接过夜，转化Top10感受态细胞，挑取单个菌落进行过夜培养，提取质粒，酶切，37℃水浴2小时，琼脂糖凝胶电泳，可以看到eae片段大小的条带出现，获得pColdⅠ‑fliC‑hcpA‑tir‑eae重组质粒，将测序正确的阳性质粒pColdⅠ‑fliC‑hcpA‑tir‑eae转化到BL21（DE3）感受态细胞中，获得多价重组菌BL21（pColdⅠ‑fliC‑hcpA‑tir‑eae）。