[发明专利]一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体为一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法。本发明包括红豆杉胚性愈伤组织的诱导培养，带有GUS基因的植物高效表达载体转入根癌农杆菌，农杆菌遗传转化胚性愈伤，转化受体材料的继代增殖培养及抗性胚性愈伤组织的筛选，抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养，PCR检测和GUS基因的检测等。本方法在红豆杉胚性愈伤组织中表达GUS基因，成功地得到红豆杉胚性愈伤组织遗传转化方法。本发明方法获得的红豆杉转基因愈伤组织可在红豆杉基因工程、细胞工程、代谢工程以及红豆杉遗传转化体系的建立中具有广泛应用。

主权项

一种获得红豆杉转基因愈伤组织的遗传转化方法，其特征在于利用红豆杉下胚轴作为外植体诱导愈伤组织，并经过培养获得胚性愈伤，用根癌农杆菌介导，将带有GUS基因的pCAMBIA1304质粒导入红豆杉愈伤组织，PCR检测外源潮霉素磷酸转移酶基因的整合情况，用组织化学方法检测GUS基因在组织中的表达情况，获得红豆杉的转基因愈伤组织；具体步骤为：(1) 红豆杉愈伤组织的诱导培养：选择下胚轴为愈伤组织诱导用外植体，在愈伤组织诱导培养基上进行暗培养，在下胚轴两端逐渐产生白色的愈伤组织，并且不断膨大；上述愈伤组织诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加激素NAA、TDZ和2,4‑D而组成；(2) 红豆杉胚性愈伤组织的诱导培养：将下胚轴诱导出的白色愈伤转接入胚性愈伤诱导培养基上，预防水样化和褐化，并获得致密的、硬度增加的胚性愈伤组织；该胚性愈伤诱导培养基是以B5培养基为基础，再添加5种氨基酸和激素2,4‑D、NAA和TDZ 而组成；(3) 遗传转化：利用根癌农杆菌介导法，将含GUS基因的植物表达载体pCAMBIA1304根癌农杆菌，以红豆杉胚性愈伤组织为受体进行遗传转化；(4) 抗性胚性愈伤组织的脱菌、筛选和增殖培养：经过遗传转化，然后在恢复培养基上进行脱菌培养，在筛选培养基上进行筛选培养，获得具有潮霉素抗性的愈伤组织；将抗性愈伤组织接入胚性愈伤组织继代培养基进行增殖培养，增加抗性愈伤组织的数量；(5) PCR检测和GUS组织化学染色方法检测转基因愈伤：PCR检测pCAMBIA1304质粒上带有的潮霉素磷酸转移酶基因；GUS组织化学染色，将愈伤组织浸入配制好的GUS染色液中，37℃染色过夜，愈伤组织中的蓝色为报告基因GUS组织化学染色，表明外源基因已经整合到受体细胞的染色体中并表达。