[发明专利]滇青冈与牛肝菌纯共生体的建立方法

摘要

本发明涉及一种滇青冈与牛肝菌纯共生关系的建立方法，属于生物技术领域（植物组织与真菌培养）。在菌根真菌的研究中，尚难以建立一个稳定的植物与真菌的纯共生体。牛肝菌目前尚难以人工栽培，属于一类与植物共生的菌根真菌，在自然条件下与松科、壳斗科等植物形成共生关系。本发明以武定狮子山采集的滇青冈种子及一株广义美味牛肝菌子实体为材料，成功地分别诱导了愈伤组织、菌丝体，并对愈伤组织与菌丝体进行了创新性共培养，在无菌状态下建立了一个简单稳定的纯共生体系。这为今后进一步研究牛肝菌与滇青冈等植物的共生关系、共生机理、牛肝菌子实体发生的分子机制等奠定了重要基础，也为其它大型真菌与共生植物的研究提供了方法借鉴。

主权项

一种滇青冈与牛肝菌纯共生关系的建立方法，其特征为，利用野外采集的滇青冈(Cyclobalanopsis glaucoides )种子培养无菌苗，诱导愈伤组织，利用野外采集的美味牛肝菌(Boletus edulis s.l.)子实体诱导菌丝体，将愈伤组织与菌丝体进行共培养，室内建立共生关系，主要包括下列步骤：（1）滇青冈愈伤组织的诱导及培养：于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗2次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗2～3次；将消毒处理后的种子芽胚朝上接进萌发培养基，每瓶接种1～2颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养9～12天后开始萌发，转入2000～ 2500Lux的光照下培养20～23天，长成8～10cm的高茎杆小苗（叶少茎长）；将小苗的茎截下，裁剪成1.0～1.5 cm长的小茎段，将其接种至愈伤组织诱导培养基中，每瓶接种1～2个茎段，21～22℃下暗培养10～13天后，与培养基接触的茎段基部开始膨大，并逐渐分化出愈伤组织，30～35天愈伤组织直径达2.0～3.0 cm；将已长成的愈伤组织均匀切分成6～8小块，接种至继代培养基中，19～23天，形成疏松的团块状组织，48～51天愈伤组织逐渐老化，色泽加深；（2）美味牛肝菌菌丝体的诱导及培养：于狮子山采摘生长优良、无虫害、未开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的美味牛肝菌子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为二，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0.30～0.50cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，培养温度为22～23℃，暗培养7天，菌块周围开始萌发出白色菌丝，60天菌丝体基本长满培养基；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基进行扩大培养；（3）滇青冈愈伤组织与牛肝菌菌丝体的共培养：将上面已继代生长30～35天的滇青冈愈伤组织取出，切分成大小相近的8～10块，分别将切好的愈伤组织接种进共培养培养基中，每瓶接一个，将培养皿中已扩繁的菌丝体用1 cm直径的打孔器截取，将截取的4个菌丝块围绕已接种的愈伤组织进行4个方向的等距离接种，30～35天建立起一个无菌稳定的共生体系。