[发明专利]敲除脯氨酸合成途径提高钝齿棒杆菌精氨酸产量的方法

摘要

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，具有多种独特的生理和药理作用。本发明主要针对精氨酸合成的竞争旁路代谢关键酶基因进行敲除。以钝齿棒杆菌基因组为模板，分别以proB基因上下游引物进行PCR扩增，利用重叠PCR扩增获得缺失型基因proB’。连接重组质粒pK18mobsacB-proB’电击转化进入钝齿棒杆菌，筛选二次同源重组基因缺失型菌株。将上述重组菌钝齿棒杆菌ΔproB进行摇瓶发酵实验，钝齿棒杆菌中proB基因的功能缺失，使得脯氨酸合成的能力大大降低，同时提高了糖耗，发酵液中脯氨酸的积累量只有对照菌株的2.7％，从而使目标氨基酸L-精氨酸产量提高。

主权项

一种脯氨酸合成关键酶缺失型基因ΔproB，其特征是：以保藏编号为CCTCC NO：M208133的C.crenatum SYPA菌株DNA为模板，通过重叠PCR法将获得来自钝齿棒杆菌SYPA的脯氨酸合成关键酶基因proB中的了352个核苷酸碱基缺失；重叠PCR的引物序列为：第一轮PCR引物序列：PproBF EcoRI 5’‑CGCGAATTCATGCGTGAGCGCATCTCCAACGCPproBR SalI 5’‑CGCGTCGACTTACGCGCGGCTGGCGTAGTTGGAC第二轮PCR引物序列：PΔproB R 5’‑CCCATCCACTAAACTTAAACACGCACGATCACGCTTTCCTGCATCPΔproB F 5’‑TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGTGTCTGCTGCACGTTTGGCT。