[发明专利]一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法

摘要

一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法属分子生物学与基因工程技术领域，本发明包括的步骤：大豆种子基因型选用、消毒和萌发；含有抗线虫Bt基因的发根农杆菌K599菌液制备；发根农杆菌介导的大豆转化；转基因根的组织化学染色分析；转基因根的PCR检测。本发明首次将发根农杆菌介导的真空渗透辅助转化方法应用到大豆，并成功进行了大豆根部毛状根转化；本发明先将大豆种子消毒后种植在无菌蛭石萌发，在下胚轴上端造成表皮分生细胞损伤，再进行真空条件下发根农杆菌侵染，进行遗传转化，获得含有抗线虫BT基因的大豆转基因毛状根，实施本发明能充分提高农杆菌入侵的机会，可明显提高农杆菌的感染效率，有效提高大豆的转化率。

主权项

一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法，其特征在于包括下列步骤：1)大豆种子的基因型选用、消毒和萌发，具体包括：1.1大豆种子的基因型选用“吉豆2号”，且需挑选发育饱满无病害的；1.2用常温氯气熏蒸法，其中氯气由100ml5.24％NaCIO+3.5ml12mol／L HCI产生，置于干燥器中熏蒸14h进行灭菌；1.3在超净工作台中取出无菌大豆，接于无菌湿蛭石表面下方1‑2cm处，用保鲜膜封盖；1.4置于25℃暗培养室中进行诱芽的培养，5d后，以备进行发根农杆菌侵染；2)含有抗线虫Bt基因的发根农杆菌K599菌液的制备，具体包括：2.1将包含植物双元表达载体pBI121‑Bt06的发根农杆菌K599，在固体LB平板上划线，28℃倒置培养48h；所述的包含植物双元表达载体pBI121‑Bt06的发根农杆菌菌株K599是通过常规的农杆菌冻融法将pBI121‑Bt06质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞获得；2.2挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，220rpm、28℃振荡培养24h；2.3按1：10的比例将摇好的菌液加入到50mL液体LB培养基中，220rpm、28℃振荡培养3‑6h，使菌液OD600达到1.3；2.43000rpm离心10min，弃上清，沉淀重悬浮于侵染液中：MSB+100μmol/L As，pH5.4，使其OD600稀释至0.5，备用；3)发根农杆菌介导的大豆转化，具体包括：3.1在萌发的大豆种子的下胚轴的上端，用解剖刀划伤后放至制备好的农杆菌侵染液中，在0.06‑0.08MPa真空压力条件下侵染10‑20min，同时以无菌水作为对照；3.2将侵染后的大豆移至花盆中，并用灭菌的混蛭石将其覆盖，25℃、12h光照，保持湿度在75％以上，温室培养2‑3周，培养期间每天用无菌的B&D溶液浇灌植株，其中B&D溶液是由500μL SolutionA，500μL Solution B，500μL Solution C，500μL Solution D组成，其中包含0‑2mmol/L硝酸钾作为氮源，Solution A为2mol/L二水合氯化钙，Solution B为1mol/L磷酸二氢钾，Solution C为20mmol/L柠檬酸铁，Solution D为0.5mol/L硫酸镁、0.5mol/L硫酸钾、2mmol/L硫酸锰、4mmol/L硼酸、1mmol/L硫酸锌、4mmol/L硫酸铜、0.2mmol/L硫酸钴、0.2mmol/L钼酸钠；3.3当根长到5‑10cm时，将新发出的根以下1cm处的初生根切去，并将植株移到新的花盆中，用湿蛭石复盖后，置于温室继续培养；4)转基因根的组织化学染色分析，具体包括：4.1取侵染后新发出的大豆根部和对照的根部，分别与X‑Gluc染色液混合培养，避光37℃放置过夜；所述的X‑Gluc染色液的配方为：3mg/ml X‑gluc、50mM PH=7.0的磷酸钠缓冲溶液、10mM EDTA、0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、0.1％TritonX‑100、10％甲醇；其中的X‑gluc为5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑β‑D‑葡糖苷酸，其中的百分比为体积百分比；4.2弃去染色液，用25％、50％、75％和100％酒精浸泡进行脱色，观察并拍照记录GUS的表达情况，其中的百分比为体积百分比；5)转基因根的PCR检测，具体包括：5.1根据Kan序列对其设计引物如下：上游序列5'‑TTGGGTGGAGAGGCTATTCG‑3'下游序列5'‑TATCACGGGTAGCCAACGCT‑3'；5.2用CTAB法提取生长旺盛的毛状根的DNA，以DNA为模板对Kan基因进行PCR扩增，若PCR扩增出预期大小为641bp的目的条带，与预计大小一致，测序验证为Kan基因序列，而野生型根未能扩增出任何条带，表明获得的毛状不定根为转基因不定根。