[发明专利]人工条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种人工饲喂条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒（Ricedrawfvirus，RDV）的方法及应用。用培养的感染水稻矮缩病毒的水稻或者冷冻保存的水稻病叶饲喂黑尾叶蝉，使黑尾叶蝉获毒，接着将黑尾叶蝉转移至健康水稻上饲喂，直到渡过病毒的循回期，利用RT-PCR技术和血清学方法对黑尾叶蝉的带毒情况进行鉴定。利用该发明获得的携带RDV的黑尾叶蝉可用于筛选抗RDV的单抗，从而以单抗为核心建立dot-ELISA和TAS-ELISA等血清学方法，进而对该病毒病的发生流行进行监测；此外，获毒的黑尾叶蝉可进行水稻接种实验鉴定水稻品种的抗性，从而筛选抗病品种；还可用于研究RDV与寄主、传毒媒介之间的互作关系，为阐述该病毒病的致病机理及提出有效的防治策略打下理论基础。

主权项

一种人工饲喂条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：1）黑尾叶蝉的获得：从非水稻矮缩病发生地区的水稻田间采集捕获黑尾叶蝉后在室内用无毒稻苗饲养，待黑尾叶蝉成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的黑尾叶蝉用RT‑PCR方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群；2）黑尾叶蝉的获毒：黑尾叶蝉从冷冻保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中获毒：饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿1～3小时；从‑10℃至‑80℃保存冰箱中取出冷冻保存的病株，移入烧杯内，每个烧杯放1～10株病株；接入20～300头3～4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，烧杯用尼龙纱布封口；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26～30℃，相对湿度为60 %～75 %，光周期为16L：8D；饲毒1～2天后将存活的黑尾叶蝉移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26～30℃，相对湿度为60 %～75 %，光周期为16L：8D，直至渡过病毒的循回期，约15～20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT‑PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉；或者，黑尾叶蝉从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒：  饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿1～3小时；感染水稻矮缩病毒的水稻病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制的植物生长箱中培养，每个塑料容器放1～3株病株植物；每个装置中放入20～200头3～4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，饲喂培养温度为26～30℃，相对湿度为60 %～75 %，光周期为16L：8D；饲毒1～3天后将存活的黑尾叶蝉移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约15～20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT‑PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉。