[发明专利]一种从百合组织中同时提取DNA和RNA的方法

摘要

本发明公开了一种同时提取百合组织中DNA和RNA的方法，该方法是利用百合组织样品经过相同的步骤粗提和纯化，得到总核酸溶液，再依次选择性沉淀RNA和DNA，得到高质量的DNA和RNA；本发明方法优点在于所用时间短、经济快速、稳定性好，并且提取的核酸质量高；其特点在于两次利用高浓度醋酸钾沉淀多糖，能有效地去除百合样品中的多糖；在DNA和RNA分离过程中，先用氯化锂和无水乙醇协同作用选择性沉淀RNA，然后利用醋酸钠和异丙醇沉淀DNA，DNA和RNA分离效率高，核酸损失小，且沉淀时间大大缩短。该方法适用于从富含多糖及其他次生代谢物质的百合组织中同时提取DNA和RNA。

主权项

一种从百合组织中同时提取DNA和RNA的方法，其特征在于它包括以下步骤：（1）取0.5‑1g百合植物组织，加入液氮研磨成粉末，按每克组织材料添加12‑15ml的异硫氰酸胍提取缓冲液的比例加入预冷的异硫氰酸胍提取液，充分震荡混匀，冰浴10‑15min，再加入提取液1/10体积的pH4.5‑5.5、3mol L‑1醋酸钠，颠倒混匀；其中异硫氰酸胍提取缓冲液成分为：4.5mol L‑1 异硫氰酸胍，25mmol L‑1柠檬酸钠，0.5%（w/v）十二烷基肌氨酸钠，3%（w/v）可溶性聚乙烯吡咯烷酮，使用前每100mL提取缓冲液加入1mL β‑巯基乙醇；（2）在步骤（1）得到的混合液中加入与提取液等体积的氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min后于4℃ 12000g离心10min，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；（3）向步骤（2）中得到的上清液中加入1/3提取液体积的pH4.5‑5.5、8mol L‑1预冷醋酸钾，颠倒混匀，冰上放置10min， 4℃ 12000g离心10min，取上清置于新的离心管中，重复此步骤一次；（4）向步骤（3）得到的上清液中加入与提取液等体积的异丙醇，混匀后‑20℃放置30min，接着4℃ 12000g离心10min，得到核酸粗提沉淀物；（5）用75%的乙醇清洗沉淀两次，室温下干燥20min，用0.5‑1mL DEPC处理过的ddH2O彻底溶解沉淀；（6）在步骤（5）得到的总核酸溶液中加入0.5‑1mLTris饱和酚/氯仿混合液，Tris饱和酚/氯仿混合液中Tris饱和酚与氯仿的体积比为1:1，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，于4℃ 12000g离心10min，取上清置于新的离心管中；（7）向步骤（6）的上清液中加入0.5‑1mL氯仿，剧烈震荡混匀，冰上放置5min，4℃ 12000g离心10min，取上清置于新的离心管中；（8）向步骤（7）的上清液中加入0.125‑0.25mL 10mol L‑1氯化锂，混匀后加入0.25‑0.5mL无水乙醇，上下颠倒混匀后‑20℃放置2h沉淀RNA，4℃ 14000g离心15min，取上清液置于新的离心管中；（9）用75%的乙醇清洗步骤（8）得到的RNA沉淀两次，室温下干燥10min，用60‑100μL DEPC处理过的ddH2O溶解RNA沉淀，‑80℃保存备用； （10）向步骤（8）得到的上清液中加入0.875‑1.75mL异丙醇和0.0875‑0.175mL pH4.5‑5.5的3mol L‑1醋酸钠，混匀后‑20℃放置30min沉淀DNA，室温下12000g离心15min，得到DNA沉淀，用75%乙醇清洗两次，在室温下干燥10min，用60‑100μL TE缓冲液溶解，于‑20℃保存备用。