[发明专利]一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法

摘要

本发明涉及一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，具体步骤如下：⑴两亲本菌体的制备，即乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的制备；⑵两亲本原生质体的制备；⑶两亲本原生质体融合；⑷融合子的检出与筛选。本发明的利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，该方法是以乳双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为亲本，利用双灭活亲本并用原生质体融合的方式，使双亲本原生质体融合而再生，获得同时具有两亲本性状的乳菌菌菌株，该方法操作简便、过程易实现，可降低生产成本，节约了能耗。

主权项

一种利用双亲灭活亲本通过原生质体融合构建乳酸菌菌株的方法，其特征在于：具体步骤如下：⑴两亲本菌体的制备分别将乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）进行液体培养，至细胞浓度为107~109个/ml，得两亲本菌体培养液；⑵两亲本原生质体的制备将步骤⑴中的两亲本菌体培养液分别洗涤得菌体细胞，再将菌体细胞分别稀释到浓度为106~107个/ml，再分别加入终浓度为5‑20mg/ml的溶菌酶并酶解；将两种酶解后的菌体细胞分别洗涤、离心，再分别重悬，即得乳双歧杆菌原生质体和嗜酸乳杆菌原生质体悬液；⑶两亲本原生质体融合将步骤⑵中乳双歧杆菌原生质体悬液和嗜酸乳杆菌原生质体悬液分别灭活后，将两亲本原生质体悬液等体积混合、离心，至原生质体细胞浓度达到106~107个/ml，得原生质体混和液；然后加入原生质体混和液质量的20‑60%的PEG6000、原生质体混和液中终浓度为0.01‑0.05mol/L的CaCl2和0.4‑0.9mol/L的NaCl，进行融合得原生质体融合液；将原生质体融合液洗净，重悬后得融合后的原生质体；⑷融合子的检出与筛选将步骤⑶中原生质体涂布于再生培养基中，培养48‑96小时，将生长出的融合子菌落转接至草酸培养基中，在草酸培养基生长出的菌株即为融合的乳酸菌菌株。