[发明专利]一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法；试剂盒的试剂包括：DNA提取液，松材线虫核酸恒温扩增反应液，阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，阴性对照为无菌双蒸水。该试剂盒利用核酸恒温扩增检测松材线虫，灵敏度可在每个反应体系中检出100拷贝；经过重复实验，检测结果无显著性差异，具有良好的重复性；且对样本的检测仅仅需要2h就能完成，大大缩短检测时间；同时本试剂盒只需要1人就可以完成所有的操作过程，可一次性检测一个到数百个样本，这样也减少了人力的浪费；可以满足快速检测松材线虫的要求，具有很好的实用性。

主权项

一种定性检测松材线虫的试剂盒，其特征在于，试剂包括：DNA提取液，松材线虫核酸恒温扩增反应液，阳性对照和阴性对照；其中，阳性对照为含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，阴性对照为无菌双蒸水；所述的松材线虫核酸恒温扩增反应液的组成为：0.1~0.2μmol正向外围引物，0.1~0.2μmol反向外围引物，0.1~0.5μmol正向交叉引物，0.1~0.5μmol反向交叉引物，0.1~0.5μmol正向探针，0.1~0.5μmol反向探针，1~6mmol MgSO4，0.2~0.4mmol dNTPs溶液，6~10U Gst DNA聚合酶，2μL 10×Thermol buffer，无菌双蒸水补足到16μL； 所述的正向外围引物序列为5’‑TCCTCACCTGGCTCTT‑3’；反向外围引物序列为’‑CTAAACTCCCCATCTC‑3’；两条探针的序列分别为：正向5’端Biotin标记探针5‑biotin‑ TCTTTTCGGCCACACC‑3’，正向3’端异硫氰酸荧光素（FitC）标记探针5‑ AGGCGTTCACCAGT‑ FITC；扩增交叉引物分别为：反向交叉引物5’‑ GTCTTTTCGGCCACACCACTGTGGTCGAGAACC ‑3’，正向交叉引物5’‑GACGTCGCATGTAGC‑3’。