[发明专利]一种长片段末端文库的构建方法

摘要

本发明涉及一种长片段末端文库的构建方法，包括有1）DNA随机打断、末端缺口补齐修复；2）制成A-Fragment步骤；3）将A-Fragment与LMP Adaptor进行粘性末端的连接；4）将LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化；5）将获得的酶消化文库中的片段再次进行环化；6）将纯化后的环状分子用LMP Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成LMP文库的构建。本发明的建库方法，只需要合成两条63 bp的寡核苷酸序列，进行简单的分子生物学连接、扩增等实验，获得的LMP文库两端带有测序引物序列，能够直接应用于二代测序。此外，由于二次环化后的片段中存在已知的限制性内切酶位点，能够快速分拣待测片段两端的序列，对测序数据进行有效筛选，去除嵌和序列。

主权项

一种长片段末端文库的构建方法，其特征在于，所述的方法的步骤如下：1）首先将基因组DNA随机打断，并将打断的DNA进行末端缺口补齐修复；2）将修复的DNA片段的3′端加上脱氧腺苷酸A，制成A‑Fragment；3）将制成A‑Fragment与3′端带有突出的脱氧胸甘酸T的 LMP Adaptor进行粘性末端的连接，获得环状的LMP‑Adaptor‑Fragment；4）将去除了未环化的线性分子的LMP‑Adaptor‑Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化adaptor以外的区域，获得相应的酶消化文库；   5）将步骤4）获得的酶消化文库中的片段进行末端缺口补齐修复后，按照步骤3）再次进行环化；6）将步骤5）获得的环化产物用核酸外切酶消化去除未环化的线性分子；用纯化后的环状分子作为模版，LMP Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成长片段末端文库的构建。