[发明专利]猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法

摘要

本发明提供了猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法，包括如下具体步骤：1）根据GenBank中TGEVN基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物；2）制备病毒液，-80℃备用；3）提取TGEV的RNA；4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，进行RT-LAMP反应；5）琼脂糖凝胶检测RT-LAMP反应结果。本发明所述猪猪传染性胃肠炎TGE的RT-LAMP检测方法与传统方法相比，具有以下优点1.操作简单。2.快速高效。3.高特异性。4.高灵敏度。

主权项

猪传染性胃肠炎TGE 的RT‑LAMP检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：1）根据GenBank中TGEV N基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物如下：  FIP  5’GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’BIP 5’CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’F3    5’GCTATCGCATGGTGAAGG3’B3    5’CAAGTTGAAATTCGCCTGG3’；2）用常规方法将PK‑15细胞传代培养，待其长成单层，将TGEV Purdue株冻干毒用DMEM稀释后接种于细胞上，在37℃，5% CO2 培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于37℃，5% CO2培养箱中，待细胞出现明显病变，刮取细胞收获病毒液，‑80℃备用；3）提取 TGEV的RNA；4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，按照下述条件进行RT‑LAMP反应：10×Bst buffer 2.5µL、AMV（5U/µL）0.5µL、Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（1mol/L）3µL、Calcein（250µmol/L）3µL、MnCl2 （25mmol/L）0.5µL、MgSO4（100mmol/L）0.5µL、BIP（10mmol/mL）3µL、FIP（10mmol/mL）3µL、LB（10mmol/mL）2µL、F3（10mmol/mL）0.5µL、B3（10mmol/mL）0.5µL、dNTPs （10mmol/L）3µL、模版RNA（7.28µg/µL）2µL，用去离子水补足25µL；反应条件为：62℃1h，80℃10min；5） 可视化观察RT‑LAMP反应结果;6）琼脂糖凝胶验证可视化RT‑LAMP反应结果。