[发明专利]利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法

摘要

本发明涉及重组人酸性成纤维细胞生长因子（FGF1），具体是利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法，其包括利用PCR方法扩增后得到人FGF1全长基因PCR产物；将PCR产物用内切酶酶切。本发明将人酸性成纤维细胞生长因子全长基因克隆至pMAL-p5X表达载体上，重组质粒在大肠杆菌中高效表达含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白，该蛋白为可溶性表达，利用MBP亲和层析柱，将带有MBP融合标签的蛋白纯化出来，再利用TEV酶的结合位点，用TEV消化纯化后的融合蛋白，得到完整的不含融合标签的FGF1蛋白，不仅可溶性较高，而且产品纯度较高。

主权项

利用大肠杆菌制备FGF1全长蛋白的方法，包括：（1）利用PCR方法，从人胎脑的Quick Clone cDNA中扩增人FGF1的全编码序列，扩增后得到目的片段大小为468bp，用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物；（2）将上述PCR产物用内切酶酶切，得到N端有BamHⅠ、C端有HindⅢ粘性末端的酶切片段，回收后将该酶切片段连接至BamHⅠ和Hind Ⅲ消化好的pMAL‑p5X表达载体；（3）将上述连接产物转化至大肠杆菌DH5a，经培养抽提、测序、分析后，得到测序正确的人FGF1全长cDNA序列的重组质粒；（4）将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌 BL21，进行培养、诱导表达后离心、洗涤、裂解并收集细菌沉淀；（5）重悬上述细菌沉淀, 加入MgCl2溶液，离心得到上清，在上清中加入Tris‑Cl后用过滤器过滤、透析，得到含有MBP融合标签的FGF1全长蛋白；（6）将透析后的液体上到直链淀粉琼脂糖柱上，用洗涤缓冲液冲洗后用洗脱缓冲液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱的蛋白；（7）将上述收集到的蛋白进行TEV酶切，孵育后将酶切蛋白液又一次上到直链淀粉琼脂糖柱上，收集上样后流出的液体；（8）将上述上样后流出的液体再次上样于Ni‑NTA层析柱，过滤再次上样后流出的液体，得到纯化后的FGF1全长蛋白。