[发明专利]传染病病原体全人源化抗体的制备方法

摘要

本发明涉及一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法。该方法主要包括以下步骤：传染病病原体抗原的制备；传染病病原体抗体的荧光标记；传染病患者外周血B细胞的富集与纯化；标记的病原体抗原与抗原特异性B细胞的结合；流式细胞仪筛选抗原特异性的单个B细胞；单细胞RT-PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因；与重链和轻链恒定区连接构建人源抗体的真核表达载体；重组抗体在真核细胞中的高效表达与纯化。本发明所制备的人源单克隆抗体既可以用于传染病的诊断，也可用于传染病的治疗。

主权项

一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤：（1）传染病病原体抗原的制备：以常规方法在真核或原核细胞中生产并纯化重组传染病病原体抗原蛋白；（2）抗体的标记：将上步纯化的重组传染病病原体抗原蛋白以荧光或生物素标记；（3）B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；（4）标记抗原与特异性B细胞的结合：将步骤（2）中标记的重组传染病病原体抗原蛋白与步骤（3）中的B细胞进行特异性结合；（5）抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选、分离出上步中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；（6）扩增抗体可变区基因：采用核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:58所示系列特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT‑PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；（7）构建表达载体：将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；（8）重组抗体表达与纯化：以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。