[发明专利]一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法及试剂盒，采用间接ELISA法检测家兔血清抗苦马豆素抗体，包括以下步骤：(1)包被；(2)封闭；(3)添加待检血清及阳性、阴性血清；(4)添加酶标二抗；(5)添加底物溶液；(6)终止。通过该方法的实施，达到对家兔免疫效果的快速、敏感、准确的判断，操作方法简单易行，适用于科研院所和基层畜牧系统。

主权项

一种家兔抗苦马豆素抗体的ELISA检测方法，其特征在于，间接ELISA法检测家兔血清抗苦马豆素抗体，包括以下步骤：(1)包被：使用抗原包被缓冲液将苦马豆素人工抗原稀释到工作浓度，加入96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜；(2)封闭：将孔内抗原液弃去，加入PBST洗涤液，每孔200μL，振荡30s后弃去孔内液体，拍干，PBST洗涤液的配制方法：十二水磷酸氢二钠2.9g，无水磷酸氢二钾0.2g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，吐温‑200.5mL，溶解于1000mL蒸馏水；重复洗涤3次后，每孔加入20g/L明胶溶液，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h进行封闭；(3)添加待检血清及阳性、阴性血清：弃去孔内明胶溶液，洗涤3次后，向每孔加入100μL工作浓度的待检血清、阳性血清和阴性血清，并以PBS溶液为空白对照，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h；(4)添加酶标二抗：弃去孔内血清，洗涤3次后，向每孔加入100μL工作浓度的HRP‑羊抗兔酶标抗体，将酶标板置于37℃培养箱内培养1h；(5)添加底物溶液：弃去孔内溶液，洗涤3次后，向每孔加入100μL底物溶液，底物使用四甲基联苯胺，即TMB，配置方法为：底物显色A液：无水醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，用蒸馏水定容于500mL；底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50mL，0.15g TMB，3mL DMSO，用蒸馏水定容于500mL，使用时AB液等量混合，将酶标板置于37℃培养箱内培养30min；(6)终止：将酶标板拿出培养箱后，立即向每孔加入2mol/LH2SO4溶液终止反应，立即使用酶标仪测定OD450值，以待检血清OD450值(P)和阴性血清OD450值(N)的比值(P/N)≥2.1判定样品为阳性。