[发明专利]一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒

摘要

本发明提供一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT-PCR试剂盒，由定量RT-PCR反应液管、酶混合液管、引物探针混合液管、阴性对照品管、三个标准品管、三个阳性对照品管和盒体组成。标准品为GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒标准品。对照品为阳性和阴性对照品。本发明试剂盒根据GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区序列设计特异性的引物和探针，采用一步法三重实时荧光定量RT-PCR技术，可以从标本中准确检测出GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒。试剂盒设计合理，操作简便、快速和准确。

主权项

一种检测人杯状病毒的三重荧光定量RT‑PCR试剂盒,其特征在于，该试剂盒由定量RT‑PCR反应液管(1)、酶混合液管(2)、引物探针混合液管(3)、阴性对照品管(4)、三个标准品管（5）、三个阳性对照品管（6）和盒体（7）组成，其中定量RT‑PCR反应液管（1）包含有PCR反应缓冲液、氯化镁和三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物，酶混合物管（2）包含耐热Taq DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和MMLV逆转录酶；引物探针混合液管（3）包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒、札如病毒三种病毒的特异性引物和相应的三种荧光标记的探针；三个标准品管（5）分别放置GI型诺如病毒标准品、GII型诺如病毒标准品、札如病毒标准品；三个阳性对照品管（6）分别放置GI型诺如病毒阳性对照品、GII型诺如病毒阳性对照品、札如病毒阳性对照品；阴性对照管(4)包含高温高压灭菌的焦碳酸二乙酯处理水，三个阳性对照品分别为包含GI型诺如病毒、GII型诺如病毒和札如病毒的保守区基因序列的阳性质粒样品；检测用上游引物和下游引物以及相应的特异性探针序列如下：上游引物NVGI‑F: 5’‑ ATGTTCCGBTGGATGCGSTT‑3’下游引物NVGI‑R：5’‑ TCCTTAGACGCCATCATCATTTAC‑3’特异性探针NVGI‑P: 5’‑FAM‑ACAGGRGATCGCRATCTYCTGCC‑BHQ1‑3’上游引物NVGII‑F: 5’‑GARCCNATGTTCAGRTGGATG‑3’下游引物NVGII‑R: 5’‑CGACGCCATCTTCATTCACA‑3’特异性探针NVGII‑P: 5’‑ HEX‑TCACRTGGGAGGGCGATCGCAA­‑BHQ1‑3’上游引物SV‑F: 5’‑ CAGGCTCTCGCCACCTACA‑3’下游引物SV‑R: 5‑ TGCCCTCCATCTCAAACACTATT‑3’特异性探针SV‑P: 5’‑ROX‑ CTTGGTTYATAGGTGGTACAGTRCC‑BHQ2‑3’所述的三种标准品基因序列如下：GI型诺如病毒病毒标准品序列为：ATGGCAAGCC ATGTTCCGTT GGATGCGGTT CCATGACCTT GGTTTGTGGA CAGGAGATCG CAATCTCCTG CCCGAATTTG TAAATGATGA TGGCGTCTAA GGACGCCCCT   CAAAGCGCTG   ATGGCGCAAGII型诺如病毒病毒标准品序列为：ACGTGCCAAG ACAAGAGCCA ATGTTCAGAT GGATGAGATT CTCGGATCTG AGCACGTGGG AGGGCGATCG CAATCTGGCT CCCAGTTTTG TGAATGAAGA TGGCGTCGAA   TGACGCCACT    CCATCTAA札如病毒标准品序列为：AACACCAACT ATGACCAGGC TCTCGCCACC TACAATGCTT GGTTCATAGG TGGTACAGTA CCTGACCCAG TGGGTTACAC TGAAGGAACC CACAAAATAG TGTTTGAGAT   GGAGGGCAAT   GGCTCCAACT   CAGA 。