[发明专利]一种细菌通用PCR检测方法

摘要

本发明公开一种细菌通用的PCR检测方法，包括样品处理、核酸提取、PCR扩增、PCR产物克隆、测序等步骤，本发明的建立的细菌通用PCR检测方法，可快速鉴别不同细菌，敏感性、准确性优于传统检测方法，解决了特异性PCR逐个筛选鉴别病原的繁琐性；该方法可用于生产中疑似细菌污染产品及临床病料样本的快速检测，有利于提高生产效率以及疾病的快速准确诊断，本发明克服了传统微生物培养方法的限制，操作方便，检测快速准确且灵敏度高，已广泛应用到菌种鉴定，群落对比分析等领域，是一种客观和可信度较高的鉴别方法。结果表明本发明的PCR检测方法具有良好的特异性和较高的敏感性，同时为细菌快速诊断试剂盒研发奠定了基础。

主权项

一种细菌通用的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）样品处理：无菌条件下从样本中分离细菌，划线接种于营养琼脂平板、血液琼脂平板和麦康凯平板上，置恒温培养箱中，培养，获得单菌落；单菌落用单菌落接种液体培养基培养；收集菌液，在液氮和35‑40℃下，分别反复冻融裂解细菌或超声波破碎细菌，之后消化处理；2）核酸提取：将处理后的样本，用总核酸试剂盒提取核酸，核酸提取后用分光光度计测核酸浓度；3）PCR扩增：设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2加入到PCR反应体系中对细菌DNA模板进行PCR扩增；4）PCR产物克隆、测序：PCR产物纯化回收，使用分光光度计检测核酸浓度，回收产物16℃过夜连接PMD‑18T克隆载体进行克隆；随机挑选克隆产物中的10个菌落，分别于AMP+LB液体培养基培养3～6小时，用上述引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR进行鉴定，电泳观测结果，PCR结果阳性的样本菌液送测序公司进行测序。