[发明专利]一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法

摘要

本发明公开了一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，属于生物技术领域。本发明利用PEG介导的原生质体转化方法，通过尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体的制备和转化以及转化子的筛选，将含有筛选标记的外源DNA片段转化入尖孢镰刀菌芝麻专化型基因组中。本发明实现了PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体转化，建立了一套完整的遗传转化、筛选方法，获得大量高强度表达潮霉素抗性蛋白和绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化菌株，转化效率可达7667个转化子/mg DNA。另外，本发明转化时所用载体具有增强型绿色荧光蛋白基因以及真菌中的强启动子gpd，有效提高了转化菌体所发出的荧光强度。

主权项

一种PEG介导的尖孢镰刀菌芝麻专化型原生质体遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝的收集将尖孢镰刀菌芝麻专化型菌丝接种于PDB液体培养基，振荡培养后，收集孢子；将孢子转移到YEPD液体培养基中，振荡培养后，收集菌丝；2）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的制备a、在步骤1）收集的菌丝中加入原生质体裂解缓冲液，振荡培养；b、过滤酶解混合物，离心，弃上清液，收集原生质体沉淀；c、在原生质体沉淀中加入STC缓冲液重悬，离心，弃上清液；再重复步骤c两次；d、在步骤c的沉淀中加入STC缓冲液重悬至2‑5×10⁷个原生质体/mL；3）尖孢镰刀菌芝麻专化型菌株原生质体的转化a、在原生质体悬浮液中加入pBHt2‑eGFP质粒，混匀后静置；再加入40%PTC缓冲液，混匀后静置；最后加入TB3培养基，室温振荡培养；b、将步骤a得到的培养物离心，弃上清液，用STC缓冲液重悬；再加入未凝固的BottomAgar培养基，混匀后倒平板，室温培养；最后将未凝固的Top Agar培养基覆盖到Bottom Agar平板上，培养至转化子长出；c、挑取单个转化子到含有200μg/mL潮霉素的PDA培养基上，筛选培养，得到纯和转化子。