[发明专利]体外培养杀伤性T细胞的方法

摘要

本发明涉及体外培养杀伤性T细胞的方法。具体而言，本发明经IL-2和抗CD3单克隆抗体联合大青叶水煎剂协同刺激取自50ml离体血液的淋巴细胞即可将其诱导为具有细胞毒活性的T细胞，本发明的诱导培养方法获得的具有细胞毒活性的T细胞增殖数量多，活力好，CD8阳性T细胞数可从20%-30%增加至80%-90%。同时，本发明采集血量少，操作步骤简单，试剂成本低，细胞成熟时间短，8天即可达到1×109个细胞以上并可供患者静脉连续输注6次，每次均达到1×109个细胞以上。本方法适用于临床上肿瘤患者的生物免疫疗法，可广泛推广应用。

主权项

一种培养人细胞毒性T细胞的方法，其包括如下步骤：a）获得无菌人全血50‑100ml；b）用PBS按照1：1比例稀释上述人全血，在塑料离心管中预先加入Ficoll‑Hypaque淋巴细胞分离液，按分离液：稀释后血液=1：1～5的比例将稀释后的血液加到Ficoll‑Hypaque淋巴细胞分离液的上面；c）室温下1800rpm离心10～30min后弃上清，重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心8min；弃上清，再重悬入40ml PBS中，混匀；再室温下1300rpm离心5min；d）弃上清，细胞沉淀用培养基RPMI‑1640悬起，计数淋巴细胞数量；e）按2×106个细胞/ml的密度将所分离的细胞悬于RPMI‑1640无血清培养液中，悬浮培养于25cm2小培养瓶中，每小瓶细胞中加入终浓度500U/ml的IL‑2；f）第二天或第三天，每瓶培养细胞中加入终浓度50ng/ml的抗CD3单克隆抗体；g）第五天或第六天，每瓶培养的细胞按1：3比例传代于75cm2中培养瓶，并加入终浓度为0.4～1.6mg/ml的FS；h）第八天至第十天，细胞数量可增殖到用于临床治疗的水平，其中FS是指大青叶水煎剂。