[发明专利]一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法有效

专利信息
申请号: 201210546243.6 申请日: 2012-12-15
公开(公告)号: CN103048460A 公开(公告)日: 2013-04-17
发明(设计)人: 彭俊;朱小波;庞代文;张志凌;余慧 申请(专利权)人: 武汉珈源生物医学工程有限公司
主分类号: G01N33/577 分类号: G01N33/577
代理公司: 武汉华旭知识产权事务所 42214 代理人: 刘荣
地址: 430075 湖北省武汉*** 国省代码: 湖北;42
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摘要: 发明提供了一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法,该方法采用具体步骤是:(1)量子点标记蛋白液的制备,(2)量子点标记蛋白检测液的制备,(3)制备包被有检测指标的反应膜,(4)在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤(3)制得的反应膜以及吸水垫,得到试纸板,将试纸板切割成试纸条,将试纸条装载于试纸卡内,(5)定性或定量检测。这种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法是一种高灵敏度、多指标同时检测、简便、直观、价格低廉、应用广泛的量子点荧光免疫层析试纸条快速检测方法。
搜索关键词: 一种 用量 荧光 免疫 层析 试纸 检测 方法
【主权项】:
一种用量子点荧光免疫层析试纸条检测的方法,其特征是至少采用如下步骤:(1). 量子点标记蛋白液的制备:取浓度为1μM‑10μM的0.2‑2nmol羧基水溶性CdSe/ZnS量子点平衡至室温,并用超声波处理;将量子点、EDC、蛋白均用20mM~200mM 、pH6.0~7.4的磷酸盐溶液或硼酸盐溶液溶解;按照1μmol~5μmol EDC/2nmol量子点的比例加入EDC,EDC即碳二亚胺盐酸盐,涡旋振荡混匀,再按1nmol~100nmol 蛋白/1nmol量子点的比例加入浓度为1~10mg/mL的蛋白,涡旋混匀,室温搅拌反应1‑4小时;反应结束后用截留分子量为10kDa‑100kDa的离心超滤管超滤浓缩至20‑100μL,然后采取凝胶尺寸排阻色谱法进行纯化,收集有荧光的部分,再用离心超滤管浓缩至量子点浓度为0.2‑2μmol/L,保存于10mM‑100mM、 pH为7.4~9.0的、含有质量百分比浓度为0.05%的NaN3的硼酸盐缓冲液中,2~8℃冰箱保存备用;(2). 量子点标记蛋白检测液的制备:将上述量子点标记蛋白液取出放置至室温,用PBS‑TBN稀释100‑1000倍成量子点标记蛋白检测液,PBS‑TBN为含20mM‑150mM氯化钠NaCl、0.02%‑0.1% 吐温Tween‑20、2mg/mL‑10m/mL 牛血清白蛋白BSA、0.05% 叠氮化钠NaN3的10mM‑100mM磷酸盐缓冲液PB,然后置于2~8℃冰箱保存备用;(3). 制备包被有检测指标的反应膜:检测指标为抗体或抗原,以硝酸纤维素膜为反应膜,将反应膜固定粘贴在PVC背衬的中间部位,将抗原或抗体用包被缓冲液调节浓度至0.1~5mg/mL,并将二抗IgG用包被缓冲也调节浓度至0.1~5mg/mL,按照0.8~1.2uL/cm的膜液量,将抗原或抗体,以及二抗IgG喷到反应膜上对应的检测区和控制区上进行包被,检测区和控制区之间间隔为3~7mm,放置25~37℃烘箱处理1‑3小时,置于恒温恒湿保藏箱里备用,所用包被缓冲液为含有20mM‑150mM氯化钠NaCl、0.05%‑3% 聚乙二醇PEG20000、0.2%‑1% 海藻糖、2mg/mL‑10m/mL 牛血清白蛋白BSA、0.05% 叠氮化钠NaN3的10mM‑100mM磷酸盐缓冲液PB;(4). 在上述PVC背衬上顺序粘贴样品垫、步骤(3)制得的反应膜以及吸水垫, 得到试纸板,将试纸板切割成试纸条,将试纸条装载于试纸卡内,得量子点荧光免疫层析试纸条;(5). 定性或定量检测:取300uL‑500μL量子点标记蛋白检测液与10μL ‑50μL待检测样本充分混匀后,取60μL‑100μL混合液加入到试纸卡上的加样孔内,反应3‑15min即可读取结果;(5.1)定性检测或半定量检测:采用紫外灯照射加样反应后的反应膜区域,通过肉眼观察条带发光情况,如果体系为检测大分子物质的双抗夹心法,当检测线出现荧光信号时判定该指标为阳性;不出现荧光信号则为阴性;如果检测体系为检测小分子物质的竞争法,则结果相反,出现荧光信号的检测线报告为阴性,未出现荧光信号报告为阳性;无论采取哪种方法,如果控制线没有荧光信号则检测结果无效;(5.2)定量检测:配备一系列不同浓度的待检分子标准溶液,然后利用荧光定量分析仪分别进行免疫层析检测,通过对每个峰面积对应浓度做标准曲线,再将待检未知样品进行同样处理,得到峰面积,根据标准曲线公式得知样品中待测分子含量。
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