[发明专利]缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法与用途

摘要

本发明是一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，它以缢蛏血窦淋巴细胞为材料，从中提取总RNA，设计特异引物，采用嵌套PCR方法，获得258bp大小的scp基因，将其插入pPICZαA表达载体，转入毕赤酵母GS115,得到表达菌株LGS-3，通过表达条件优化，获得其最佳表达条件为温度28℃，甲醇浓度1%，诱导表达时间为72h。诱导表达的产物抗菌肽对凡隆气单胞菌具有较强的抑制活性。将其应用于泥鳅养殖，饲料中添加0.5%的抗菌肽制剂，可使泥鳅在投放凡隆气单胞菌的情况下存活率提高48%左右，产量的增加28.55%左右。

主权项

1.一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）收集缢蛏血淋巴10 mL，4℃、4000 rpm下离心25 min得到血淋巴细胞，弃上清液，收集沉淀物于1.5 mL RNase-free的EP管，加入1 mL Trizol，吹打混匀后室温静置5 min，每管加500 μL氯仿，振摇30s，冰浴3 min，然后在4℃，12000 rpm下离心15 min，吸取上清液，转移至另外一支RNase-free 的EP管，用体积比为24：1的氯仿：异戊醇抽提至无蛋白沉淀，吸取上清液，加4℃预冷的500 μL异丙醇，混匀，冰上静置l0 min，4℃，12000 rpm离心15 min，弃上清；加1 mL 4℃预冷的75%乙醇洗一次，4℃，8000 rpm离心5 min，倒掉乙醇，室温倒置15 min，加10 mL DEPC处理水溶解，得缢蛏总RNA样品，置于4 ℃冷藏；（2）按下述方法对缢蛏总RNA样品进行PCR扩增：a. 反转录cDNA合成体系建立：取20 μl缢蛏总RNA样品 70 ℃下温育10 min，迅速冰上冷却，得到变性总RNA，备用；按下述方法建立反转录cDNA合成体系：将上述体积的试剂混匀，42 ℃温育60 min，95 ℃变性5 min，然后4 ℃放置5 min； b. 嵌套PCR  ①第一次PCR反应体系：第一次PCR反应程序②第二次PCR反应体系                                                 第二次PCR反应程序    所述的引物分别为：M13-MGDs   5'-ACAATTTCACACAGGAGATTGAGGTG-3   ；锚定引物1  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTC-3'  ；锚定引物2  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTG-3'  ；锚定引物3  5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTA-3’  ；      M13   5'-ACAATTTCACACAGGA-3' ；       T7     5'-ACGACTCACTATAGGG-3'  ；（3）对3’RACE扩增产物进行切胶回收，与pMD18-T载体连接后，转化E. coli DH5α，长出菌落后，筛选阳性转化子，测序得到PCR产物基因序列，命名为scp基因；（4）酵母表达载体构建：在scp基因两端加上酶切位点EcoRI和XbaI，正向引物SCPF: 5'-CGGAATTCATGAAGACATTCAGT-3'，下划线为 EcoRI 酶切位点，反向引物SCPR: 5'-GCTCTAGAGGATCCCCGGGTACC-3'，下划线为XbaI 酶切位点，从阳性转化子中扩增scp基因，再与pMD18-T载体连接后，筛选获得阳性转化子，提取质粒，用EcoRI和XbaI酶切，切胶回收带有酶切位点的scp基因片段，和同样用EcoRI和XbaI酶切的质粒载体pPICZαA按10: 1的摩尔比进行连接，转化至E. coli DH5α中，用含25 μg/mL Zeocin的LB平板筛选阳性转化子，提取表达载体质粒；（5）转化及PCR验证：用Bst I 酶切线性化重组表达载体质粒，与酵母表达宿主GS115感受态细胞混匀，在1.5 kv，25 μF，200 Ω，5 msec条件下电击，立刻加入1 M山梨醇1 mL，混匀后吸取100 μL涂于含100 mg/L Zeocin抗生素的MD平板，30℃培养，直至长出酵母重组子菌落LGS-3；提取LGS-3的DNA，使用引物5'-AOX和3'-AOX以及SCPF和SCPR 进行PCR验证；培养LGS-3菌液，按LGS-3菌液：30%甘油体积比1:1保存菌种；（6）重组蛋白的诱导表达：将LGS-3菌液接种于含50 mL BMGY培养基的250 mL三角瓶中，30℃，200 rpm 培养24 h；离心弃上清，转接到含100 mL BMMY的500 mL三角瓶中，30℃，200 rpm培养，离心，得到含抗菌肽的上清液；其中：MD培养基：13.4 g/L无氨基酵母氮源，0.4 mg/L生物素，20g/L葡萄糖，1.5%琼脂；BMGY/BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物， 100 mM pH6.0磷酸钾缓冲液，1.34% 无氨基酵母氮源，0.4mg/L生物素，1%甘油，制备BMMY时用0.5%甲醇代替1%甘油；配置方法：取l0g酵母抽提物，20 g蛋白胨，溶于700 mL去离子水中，高压灭菌20 min，冷却至室温，加入过滤除菌后的10×无氨基酵母氮源，100 mL2 mL500×生物素，100 mL10×甘油，100 mLl mol/L磷酸钾缓冲液，4℃保存备用。