[发明专利]一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法

摘要

本发明提供了一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，包括以下步骤：首先在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水、phi29 DNA 聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；将离心管加热后迅速冰浴；在离心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA 聚合酶，制得RCA反应产物；另取一只无菌离心管，进行PCR扩增，扩增后得到PCR反应产物；最后检测PCR产物的结果。该方法能够快速、灵敏的检测出柑橘冬生疫霉褐腐病原菌，本发明提供的检测方法相比于传统的利用PCR扩增的检测方法，其灵敏性至少要高出10×49倍。

主权项

一种高灵敏性检测柑橘冬生疫霉褐腐病原菌的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）、在无菌离心管中依次加入灭菌去离子水、phi29 DNA 聚合酶缓冲液、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2以及目标物DNA，然后将其混合均匀后离心，将反应液离心至管底；（2）、将离心管用PCR仪在95℃下加热3‑5min，然后迅速冰浴10‑20min；（3）、在离心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA 聚合酶，混合均匀后离心，将反应液离心至管底；（4）、将离心管置于PCR仪中，在30℃的条件下反应10‑15h，反应结束后，将离心管在65℃条件下热浴10min，使phi29 DNA 聚合酶失去活性，即可制得RCA反应产物，所制得的RCA反应产物应及时使用或‑20℃下低温保存；（5）、另取一只无菌离心管，在离心管中依次加入灭菌去离子水、PCR缓冲液、dNTPs混合物、正义引物PHIB1、反义引物PHIB2、RCA反应产物以及TaqDNA聚合酶，然后将反应液离心至管底；（6）、将离心管置于PCR仪上进行扩增，扩增后得到PCR反应产物；（7）、PCR产物用2%‑3%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭溶液染色12‑20min后，在紫外透射仪上观察PCR反应结果。