[发明专利]一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法

摘要

一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，涉及一种制备固定化脂肪酶的方法，以反相悬浮交联法制备微米级壳聚糖微球树脂作为固定化载体基体，将壳聚糖微球基质C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C6位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺分子的壳聚糖微球，经偶联戊二醛后作为脂肪酶的共价固定化载体。采用该载体对南极假丝酵母脂肪酶B进行固定化，疏水性基团和亲水性手臂分子的引入提高了壳聚糖微球对脂肪酶的固定化效率。当每克干载体投加的酶质量为40mg，室温，pH7.5的条件下固定南极假丝酵母脂肪酶3h，所得到的固定化酶活力回收率达197％，活力为481.6U/g。

主权项

一种利用两亲性壳聚糖微球载体制备固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述方法包括：a.制备两亲性壳聚糖微球载体：该载体基质为微米级壳聚糖微球，将壳聚糖微球基质C2位苯甲醛化，引入疏水相互作用基团，再用环氧氯丙烷活化C6位羟基，偶联四乙烯五胺，制备兼具疏水作用苯基和亲水性多胺手臂分子的壳聚糖微球，具体制备过程如下：⑴壳聚糖微球基质的制备：将质量分数为5%的壳聚糖溶液与PEG2000充分混合，PEG2000在溶液中的质量百分含量分别为3%，再加入与壳聚糖溶液等体积的液体石蜡及乳化剂span‑80，高速搅拌30min使体系成乳液状，然后加入0.12倍壳聚糖溶液体积的甲醛，搅拌1h后将乳液倒入10﹪NaOH/无水乙醇(V(NaOH):V(无水乙醇)=1:1)的混合液中静置1h，用二甲苯、乙醇、去离子水充分洗涤，得到粒径100~300μm的壳聚糖微球作为基质；⑵基质微球的基团修饰：称取壳聚糖微球于甲醇中，滴加苯甲醛，苯甲醛与微球质量比3~6，60℃恒温振荡反应10~16h，再加入硼氰化钠室温反应12h，抽滤洗涤后将微球浸泡在氢氧化钠水溶液中、缓慢加入环氧氯丙烷，环氧氯丙烷与微球质量比6~12，50℃振荡反应5h，抽滤洗涤后将环氧化微球置于乙醇中，加入氢氧化钠水溶液和四乙烯五胺，四乙烯五胺与微球质量比10~15，55℃反应6h，抽滤，用蒸馏水充分洗涤，干燥，得两亲性壳聚糖微球载体；⑶戊二醛活化：取两亲性壳聚糖微球置于烧瓶中，按5倍氨基摩尔数的量加入戊二醛溶液，以乙醇作为反应介质60℃反应1.5h，抽滤，然后用蒸馏水、pH7.5的磷酸缓冲液洗涤，真空干燥，得戊二醛活化载体；b. 制备固定化脂肪酶: 将戊二醛活化载体分散于磷酸缓冲液中, 室温下，加入脂肪酶，脂肪酶与载体的质量比为0.02~0.15:1，固定化温度为20~40℃，固定化时间为2~6h，固定化pH7.5~8.0,在摇床中振荡2~6h，吸去酶液，用磷酸缓冲液清洗固定化酶至洗液中不含蛋白，所得固定化酶放于4℃冰箱中保存即可。