[发明专利]非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法

摘要

非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，记录不同条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。该方法优于以往研究膜蛋白转运功能的同位素示踪法，主要表现在其安全性，简便易行，以及成本低。

主权项

非放射性判别膜蛋白质转运功能的方法，其特征在于步骤为：将天然大豆蛋黄卵磷脂按照100mg/mL的比例溶于氯仿，用氮气均匀吹干溶液后，用超纯水再一次溶解析出的天然大豆蛋黄卵磷脂，并且超声得到天然大豆蛋黄卵磷脂的脂质体；将膜蛋白与上步经处理的天然大豆蛋黄卵磷脂混匀，添加底物ATP以及稳定脂质体结构的其他成分并摇匀，得到脂蛋白体重组混合物；按占总体积的比例，具体组成为：去污剂 10%wt TritonX‑114：8%，100mg/mL超声制备的微脂体：14%，10mg/mL心磷脂：8%，0.3μg/μL 膜蛋白：13%，0.1m M 底物（ATP）： 1%，0.1M PIPES 缓冲液：9%， 超纯水： 47%；将Amberlite XAD‑2大孔树脂与制备好的脂蛋白体重组混合物按照2:1的体积比例混合后放置摇床上摇匀15分钟，将混匀样品加入G75凝胶层析柱分离脂质体后，取样品与ADP按照10:1的体积比例进行转运反应；至少分三个时间点，用膜蛋白活性抑制剂：吡哆醛‑5'‑磷酸停止反应；将样品添加到G50凝胶层析柱上，进行转运反应后脂蛋白体的纯化收集；最后，将收取的脂蛋白体与乙醇以及氯仿按照1:2:6的体积比例混匀并且放置分层，取上层液400‑600μL移至新无菌管后放置在4℃冰箱保存，得到包裹的ATP和ADP，再送至HPLC仪，应用HPLC仪分析得到在至少三个反应时间条件下ADP和ATP量的变化，在此基础上记录每个条件下ADP以及ATP显示的峰面积，根据ADP、ATP的峰面积得到它们在转运反应后的相对量，结合不同的转运反应时间点得到ADP/ATP的转运趋势，若随着反应时间的增加，ATP的含量趋于降低，相对的ADP的含量趋于上升，由此可判断该膜蛋白具备转运ADP/ATP功能。