[发明专利]老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法

摘要

本发明涉及老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，步骤如下：（1）取出老年大鼠脑组织的灰质部分，制得样品组织；（2）置于胎牛血清的分离液的培养皿中经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；（3）离心，制得毛细血管；（4）将毛细血管重悬于分离液中，经消化后，制得毛细血管悬液；（5）离心后，沉淀重悬于分离液中，经Percoll浓度梯度离心，制得脑血管内皮细胞；（6）置于培养液中，经培养后，经消化传代或冻存即可。本发明采用低浓度胰酶或含1mM EDTA的PBS消化细胞，使细胞可传代3次而仍保持脑血管内皮细胞的特性；并且经冻存复苏后仍可保持脑血管内皮细胞的纯度和特性；因此，可节省大量的时间和金钱。

主权项

一种老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法，其特征在于，步骤如下：（1）将20～22月龄的老年大鼠断头后，剥去大鼠头部皮肤，然后把大鼠头浸泡在0℃的含2%（体积百分数）胎牛血清的分离液中5～10分钟，取出，取出脑组织，取灰质部分，制得样品组织；（2）把样品组织置于5ml冰冷的含8%（体积百分数）胎牛血清的分离液的培养皿中剪成样品组织小块，补加8%（体积百分数）胎牛血清的分离液至25ml，经吹打分散和生物酶消化后，制得分散细胞；（3）向步骤（2）制得的分散细胞补加10ml8%（体积百分数）胎牛血清的分离液，混匀后第一次离心；移去上清，加20ml含20%（体积百分数）牛血清白蛋白的DMEM培养基，吹打混匀后，第二次离心，取最下层的沉淀，制得毛细血管；（4）将步骤（3）制得的毛细血管重悬于1ml的分离液中，再加入7.9ml的分离液，经生物酶消化后，制得毛细血管悬液；（5）将步骤（4）制得的毛细血管悬液，经第三次离心后，移去上清，沉淀重悬于2ml的分离液中，然后轻轻地把悬液置于Percoll浓度梯度离心液的顶部；在4℃，1000g离心10分钟，分为六层，取第三层悬浊液即为脑血管内皮细胞；（6）将步骤（5）制得的脑血管内皮细胞溶于1ml的内皮细胞培养液中，于在10cm的培养板或6孔板中培养，正常条件下培养1天，然后用1×PBS缓冲液洗除去死亡的细胞，用含3～4μM/ml嘌呤霉素的内皮细胞培养液纯化2～3天后，更换为正常的脑血管内皮细胞培养液培养7～10天，用0.01%（重量百分数）胰酶或含1mM EDTA的PBS消化传代或冻存即可。所述培养板或6孔板制备方法如下：先用1×Collagen IV铺板30分钟，然后再用1×Fibronectin铺板30分钟。