[发明专利]一种抗癌药物的新型筛选方法

摘要

本发明公开了一种抗癌药物的新型筛选方法，其关键在于包括以下步骤：(1)TTLL12过表达Hep-2细胞株的制备；(2)选用阳性对照和阴性对照药物；(3)硝基化酪氨酸最适浓度和待测药物最适稀释浓度的获得；(4)筛选药物，最后检测读数并进行比较。本发明公开了一种抗癌药物的新型筛选方法，具有方法简单，只要掌握了细胞培养和Elisa技术，就掌握了本法；快捷而便宜；试剂较少，变异因素较少而稳定，灵敏度高、特异性好、易于推广和可进行大规模筛查等特点，且通过本实验可以同时获得待测药物是否具有抗癌作用和其抗癌作用机理两种信息，大大加快了待测药物应用于临床的速度，有望挽回更多患者的生命。

主权项

一种抗癌药物的新型筛选方法，其特征在于包括以下步骤：(1)TTLL12过表达Hep‑2细胞株的制备自行设计引物，正义链5’‑CGGGATCCCCGATGGACTACCACGAGGA‑3’，反义链5’‑CGGGATCCTAGCTACAGGACGCCCCCG‑3’，以TTLL12cDNA为模板扩增TTLL12基因片段，获得目的基因片段的大小为2818bp，再将TTLL12基因片段插入pSG‑5质粒中，然后将重组质粒用化学方法分别转化大肠杆菌JM109，再将重组质粒转染Hep‑2细胞，挑选出个别表达TTLL12的克隆，继续培养，经多次传代培养，最后获得稳定过表达TTLL12的Hep‑2细胞株；(2)阳性对照和阴性对照药物的选用将100uM紫杉醇和噻丙稀分别与稳定过表达TTLL12的Hep‑2细胞株于含硝基化酪氨酸的培养液中进行培养，然后行western试验，结果可知紫杉醇能增加硝基化酪氨酸微管蛋白，具有抑制TTLL12功能的作用，可作为阳性对照；而噻丙烯不能促使硝基化酪氨酸微管蛋白的形成，不具有抑制TTLL12功能的作用，可作为阴性对照；(3)硝基化酪氨酸最适浓度和待测药物最适稀释浓度的获得将TTLL12过表达Hep‑2细胞株以每孔10000个，接种到96孔板内，MEM培养液体积为80μL，在于37℃，5％CO2培养箱内，培养6小时，分别加入终浓度为50μM，100μM，200μM，400μM，800μM硝基化酪氨酸，每孔共10μL，由于Elisa较western敏感，因此紫杉醇和噻丙烯的用量均小于100μM，分别加入终浓度为5μM，10μM，20μM，40μM等4个稀释度，每孔共10μL， 与硝基化酪氨酸不同稀释度进行方阵滴定，继续在37℃，5％CO2培养箱内，培养24小时之后，吸出96孔板孔内培养液，每孔加入100μL细胞骨架隔离缓冲液，培养3分钟，然后去除缓冲液，每孔加入100μL含有3.7％甲醛和0.05％Tween‑20的PBS固定10分钟，然后去除固定液，每孔加入100μL PBS稀释的辣根过氧化物酶标记硝基化酪氨酸抗体1∶1000，在室温下与细胞作用1小时，然后去除抗体溶液，用含有0.05％Tween‑20的PBS 200μL冲洗小孔，然后加100μL的OPD‑H2O2显色3分钟，各孔加入50μL的2moL/L H2SO4终止反应，利用检测仪在450nm处读数，最后得到硝基化酪氨酸的最适浓度为400μM，待测药物最适稀释浓度为10μM；(4)筛选药物将TTLL12过表达Hep‑2细胞株以每孔10000个，接种到96孔板内，每孔MEM培养液体积为80μL，在于37℃，5％CO2培养箱内，培养6小时，分别加入终浓度为400μM硝基化酪氨酸，每孔共10μL，待测药物和紫杉醇的终浓度均为10μM，每孔共10μL，待测药物和紫杉醇均重复6孔，继续在37℃，5％CO2培养箱内，培养24小时.之后，吸出96孔板孔内培养液，加入每孔100μL细胞骨架隔离缓冲液，培养3分钟，去除缓冲液，每孔加入100μL含有3.7％甲醛和0.05％Tween‑20的PBS固定10分钟，然后去除固定液，每孔加入100μLPBS稀释的辣根过氧化物酶标记硝基化酪氨酸抗体1∶1000，在室温下与细胞作用1小时，然后去除抗体溶液，用含有0.05％Tween‑20的PBS200μL冲洗小孔，然后加100μL的OPD‑H2O2显色3分钟，各孔加入50μL的2moL/L H2SO4终止反应，利用检测仪在450nm处读数，最后进行比较，若OD450nm值大于1，则说明该药物具有抗癌作用，并具有抑制TTLL12的功能，促进硝基化酪氨酸 与α‑tubulin的结合，通过参与微管蛋白修饰的机制，形成较多的硝基化酪氨酸微管蛋白，导致癌细胞死亡的抑癌作用机理；反之则不具有上述抑癌作用机理。