[发明专利]荧光探针杂交法检测人EGFR基因突变试剂盒

摘要

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种使用杂交探针检测EGFR基因突变位点的试剂盒。本发明创造性的使用taqman探针、PNA探针与一种多重PCR方法结合来检测EGFR突变，所有的操作在一管内完成，操作简单，不需要开盖操作，避免了污染的发生。使用TM值来判断是否发生突变。并且提供了特殊的固体形式储存方式，大大方便了运输和储存。此试剂盒主要用于诊断非小细胞肺癌患者是否适宜用易瑞沙/特罗凯等分子靶向药物。

主权项

一种人类EGFR基因突变的检测方法和试剂盒，其特征在于多重不对称PCR扩增，PNA/LNA探针作为阻滞探针，荧光杂交探针溶解曲线判断结果、以及包括固体形式存在的1xPCR反应物（由引物混合物、tris‑cl、Kcl、MgCl₂ 、热启动聚合酶、UNG酶和冻干保护剂组成）、其特殊之处在于：a：特殊的三段式引物，其三段式引物设计及后继的扩增为独创的MAP（多重单链PCR扩增）技术，其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4 、SEQ ID NO.5 、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7 、SEQ ID NO.8 ；b：特殊的探针，所选取的4个探针具有良好的特异性和保守性，可以根据Tm值的变化来判断突变，分别为SEQ ID NO.17，SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO. 20；c：特殊的存储条件:本试剂盒为PCR反应物提供了固体形式的存储方式；d：反应条件通过优化，大致分为两个阶段，其中第一阶段为富集阶段，本阶段使用浓度极低的3个引物和一个过量的正向引物，反应温度一般为50℃左右，扩增阶段低浓度引物将被消耗完，随后第二阶段仅有负向引物工作，随着扩增的进行，将产生大量的单链目的核苷酸序列；e：特殊的阻滞探针，本试剂盒使用了特殊的PNA阻滞探针来屏蔽19号外显子野生型基因的表达，大大提高了诊断的准确性。