[发明专利]一种定量测定血液循环DNA的方法

摘要

本发明公开了一种定量测定血液循环DNA的方法，取1ml同一个肿瘤患者外周静脉血，置于EDTA抗凝管中，10℃-20℃静置4小时，2000g离心5分钟，取上层血浆100ul-200ul，加入相同体积的缓冲液，充分混匀，95℃静置5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液为模板直接用于定量PCR扩增；本发明所产生的有益效果为：1、通过特殊的技术工艺处理，可以直接用血浆或血清进行定量PCR反应，不影响PCR反应，扩增效率与提纯DNA相比一致，减少了DNA提取步骤和实验误差。2、采用新型的荧光染料SuperGreen，对PCR扩增过程中的抑制作用更轻微，可使用较高浓度，荧光信号值高、反应灵敏度高可精确检测出低至纳克水平的血浆游离DNA。

主权项

一种定量测定血液循环DNA的方法，其特征在于，其步骤如下：(1)取1ml同一个肿瘤患者外周静脉血，置于EDTA抗凝管中，10℃‑20℃静置4小时，2000g离心5分钟，取上层血浆100ul‑200ul，加入相同体积的缓冲液，充分混匀，95℃静置5‑10分钟，16000g离心10分钟，取上清液为模板直接用于定量PCR扩增；(2)取10ul上述处理后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的血浆；(3)分别取2ul不同稀释倍数的血浆直接进行定量PCR扩增，取PCR体系共20ul，包括快速复活热启动DNA聚合酶1ul、SuperGreen染料1ul、2x混合物10ul、终浓度为300nM的引物4ul以及H2O4ul；95℃5分钟；95℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，重复45个循环；(4)得出Cp值为23.51±0.03，26.87±0.03，30.45±0.12。