[发明专利]便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用

摘要

本发明涉及一种便利连接基因的植物表达载体及其构建方法与应用。该载体按照如下步骤获得：用PCR的方法从出发表达载体pGreenII0229，pCAMBIA3300-35S-HAK，pGH-X6145G上（购自上海生工），pCAMBIA2300，上克隆1#、2#、3#、4#和5#片段。用NotI和MIUI分别酶切1#和2#片段并连接得到载体pJWWD-12；用XhoI分别酶切pJWWD-12和3#片段并连接得到载体pJWWD-123；用SacI分别酶切载体pJWWD-123和4#片段并连接得到表达载体pJWWD-1234；用PstI分别酶切pJWWD-1234和5#片段并连接最终得到表达载体本pJWWD-1718。本发明可方便快捷插入目的基因，目的基因可通过TA克隆插入到本载体中，大大简化了操作步骤，降低了成本，提高了工作效率。该载体的发明可为植物基因工程育种提供有力支持，并为转基因植物的安全性评价和商业化种植奠定基础。

主权项

一种植物表达载体，其特征在于按照包括如下步骤的方法得到：出发表达载体为pGreenII0229和pCAMBIA3300‑35S‑HAK，分别用引物从pGreenII0229上克隆两个片段，分别含有LB和RB，且在这两个片段上含有了大肠杆菌中的复制元件；从pCAMBIA3300‑35S‑HAK上克隆35S‑NOS片段；从pGH‑X6145G上克隆多克隆位点片段为4#片段；从pCAMBIA2300上克隆35S片段，最后将这5个片段连接在一起，构建成新的植物表达载体pJWWD‑1718；其中，RB位于从pGreenII0229克隆的1#片段5’端下游，LB位于从pGreenII0229克隆的2#片段中部；其中，所述1#片段如序列SEQ ID NO：1所示，所述2#片段如序列SEQ ID NO：2所示，所述3#片段如序列SEQ ID NO：3所示，5#片段如序列SEQ ID NO：9所示；其中，所述RB如序列SEQ ID NO：4所示，所述LB如序列SEQ ID NO：5所示，所述凝血酶基因如序列SEQ ID NO：6所示，所述大豆蛋白肽基因如序列SEQ ID NO：7所示。