[发明专利]一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法

摘要

本发明公开了一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，包括以下步骤：首先进行发酵过程中米曲霉菌体蛋白的二维电泳；质谱鉴定分析蛋白；构建了米曲霉的蛋白表达图谱。本发明的技术方案建立了米曲霉菌株的蛋白质表达图谱，从蛋白质水平提出了分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，提供了可能导致米曲霉发酵风味物质产生不同的原因。

主权项

一种分析真菌发酵过程中蛋白表达的方法，其特征在于：步骤如下：⑴等电聚焦：收集发酵过程中菌丝体，PBS缓冲液洗涤3次，加入液氮研磨至粉末状，加入适量裂解液和50μg/ml DNase I、50 μg/ml RNase，混匀，冰浴15分钟，冰浴超声2分钟，14000 rpm，4度离心30分钟取上清，从冰箱中取出美国Bio‑Rad公司的pH 4‑7的IPG预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀12小时；将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，并用上样缓冲液稀释至170μl，对好正、负极，盖上盖子，MultiphorII电泳系统进行等电聚焦；⑵平衡：聚焦结束的胶条先将胶条放入平衡缓冲液I水平振荡15分钟，再将胶条转入平衡缓冲液II水平振荡15分钟；⑶第二向SDS‑PAGE电泳：第二次平衡结束后，将胶条从样品盘中移出，放到已配好的12%的SDS‑PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5%的琼脂糖将胶条和marker封严，不能产生气泡，并将胶板固定于电泳槽内，加入电泳缓冲液，接通电源，15mA/胶恒流电泳15分钟，然后250v恒压电泳，待溴酚蓝达到底部边缘时即可停止电泳，电泳结束后，撬开两层玻璃，取出凝胶，将凝胶放入装有染色液的水平盘内振荡过夜进行染色，染色后，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡脱色；⑷蛋白点的胶内酶解：①凝胶平铺于染色盘上，切下用于质谱检测的蛋白点，用50 µL去离子水将其吹入96孔PCR板的小孔中，吸出去离子水后加入50 µL脱色液；②在50℃条件下振荡15 分钟，将脱色液吸出，重复一次，直至胶块完全呈无色状；③加50 µL去离子水，50℃振荡15 分钟，洗去残留的脱色液和胶块中的离子；④加30 µL乙腈，静置5‑10 分钟，胶块变为白色后吸出乙腈，室温静置20 分钟，使乙腈挥发； ⑤在胶块上面加6‑12 µL的酶解液，使酶解液没过胶块，封好PCR板，37℃振荡过夜酶解；⑸MALDI‑TOF 4700 Proteome Analyser质谱仪鉴定蛋白①把质谱样品板洗干净抛光，然后用异丙醇去极性后晾干，备用；②在质谱样品板四周边缘六个孔上都点上ABI公司校准液，在中间点样孔处点上0.3 µL酶解液后再点上0.3 µL质谱自带基质溶液自然混合，晾干；③冷风吹去样品板上的灰尘杂质，放入质谱仪测定；④美国ABI公司的GPS 3.5软件对质谱数据进行分析，米曲霉蛋白质数据库检索。