[发明专利]重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的制备方法，通过构建人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体胞外功能区的原核表达质粒，优化诱导蛋白表达的相关条件，制备具有更高生物活性的重组人可溶性TRAIL。

主权项

一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的制备方法，其包括如下步骤：使用上游引物(5’‑CG GGA TCC GTG AGA GAA AGA GGT C‑3’)和下游引物(5’‑CCC CCA GGT CAG TTA GC‑3’)，以TRAIL全长cDNA序列为模板进行PCR扩增，PCR产物记为TRAIL114‑281；将TRAIL114‑281和载体pET‑28a(+)使用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切回收后连接构建重组表达质粒pET‑28a(+)‑TRAIL114‑281，将其转化大肠杆菌E.coli DH5α中，通过酶切鉴定筛选出阳性转化子，将测序验证的重组质粒pET‑28a(+)‑TRAIL114‑281转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，培养后挑取单个菌落，接种到含卡那霉素(Kan)的LB培养基中培养过夜；次日将过夜的菌液接种于LB中，加入卡那霉素，36‑38℃培养，当菌体密度OD值为0.5‑0.7时，加入诱导剂IPTG和硫酸锌，24‑26℃培养3‑5h，取出菌液，离心收获湿菌；湿菌加入包含8‑12％甘油，0.3‑0.6mol/L NaCl，10‑30mmol/L tris‑Hcl，4‑6mmol/L DTT，0.5‑1.5mmol/L PMSF的缓冲溶液，超声裂解细菌，离心，收获上清，过滤除去杂质，加入咪唑使其终浓度为15‑25mmol/L，采用亲和层析法镍柱纯化TRAIL蛋白，用400‑600mmol/L咪唑溶液洗脱，收集洗脱液并置于PBS缓冲液中0‑4℃透析过夜，次日收集即为纯化后的TRAIL蛋白。