[发明专利]干细胞样肺癌细胞制备及其抗原组合物负载树突状细胞的方法与试剂盒

摘要

本发明提供了一种制备干细胞样肺癌细胞的方法，其中，所述方法包括鉴定待测肺癌细胞标本中是否存在干细胞样肺癌细胞的步骤所述步骤包括检测所述待测肺癌细胞标本中是否特异表达以下差异蛋白的至少两种蛋白激酶Ciota、五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1或乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2。本发明还提供了制备所述干细胞样肺癌细胞抗原负载该抗原树突状细胞的方法以及通过所述方法获得的树突细胞疫苗。通过本发明的方法，仅仅通过检测以上所述蛋白的至少两种，就能够高效准确地得到干细胞样肺癌细胞，基于所述方法所得干细胞样肺癌细胞纯度高且容易富集。

主权项

一种制备干细胞样肺癌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括鉴定待测肺癌细胞标本中是否存在干细胞样肺癌细胞的步骤：所述步骤包括检测所述待测肺癌细胞标本中是否特异表达差异蛋白蛋白激酶C iota以及以下差异蛋白中的至少一种：五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1或乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2；其中，所述特异表达差异蛋白是指使用蛋白免疫印迹技术检测所述肺癌细胞标本中的所述差异蛋白的结果为阳性；其中，以已知纯肺癌细胞为阴性对照，用蛋白免疫印迹技术检测100份所述阴性对照，每份含5×106个细胞，测得每种差异蛋白的灰度与标准内参β肌动蛋白的灰度比值，将所测该种差异蛋白灰度比值的平均值与标准方差之和定义为分界值；取100份待测肺癌细胞标本，每份标本含5×106个细胞，测得与阴性对照所测同种差异蛋白灰度比值的平均值，该灰度比值的平均值大于等于所述分界值，即该待测肺癌细胞标本的该种差异蛋白的蛋白免疫印迹技术检测结果为阳性；待测肺癌细胞标本是经过培养的，培养方法如下：用眼科剪将肺癌瘤组织剪碎成为1mm3的小块；所得剪碎的组织小块用0.25％胰酶溶液以1克∶0.5mL的重量体积比消化5分钟后，加入胰酶溶液体积1/5的小牛血清终止，以1000rpm离心收集消化好的组织小块，弃上清，所得离心沉淀用Accutase以1克∶1mL的体积比在37℃下混匀消化10分钟，然后在1000rpm下离心5min收集细胞，用以1克∶1mL的重量体积比的杜尔贝可改良伊格尔‑F12培养基重悬；所得重悬液用40μm分子筛过滤；用分子筛过滤，截留的是大片细胞碎片和未被消化的细胞团，滤出的是细胞悬液；收集细胞悬液后，向其中含有5ng/mLB27、40ng/mL人表皮生长因子、30ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和30mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔‑F12培养基使细胞悬液浓度被稀释为2×106细胞/mL；然后将每5mL所得稀释的细胞悬液转移至25cm2灭菌塑料培养瓶中在37℃、5％CO2培养箱中培养24h；培养所得细胞呈成神经球状悬浮生长，吸取培养基到15mL离心管中，每分钟1000转，4℃离心10分钟收集悬浮细胞，弃上清，沉淀细胞添加新鲜的含有8ng/mL B27、30ng/mL人表皮生长因子、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔‑F12培养基；当细胞球生长达到1μm时，用Accutase消化成单细胞后，用含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生长因子、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20mg/mL胰岛素的杜尔贝可改良伊格尔‑F12培养基进行传代培养；按照上述传代条件再传4代，得到成神经球状的细胞；当鉴定所述待测肺癌细胞标本中存在干细胞样肺癌细胞时，该方法还包括：使用免疫磁珠法和/或流式细胞仪分选法富集待测细胞中的干细胞样肺癌细胞的步骤；其中，利用针对差异表达蛋白激酶C iota的抗体和五次跨膜单链糖蛋白Prominin1、乙醛脱氢酶1或乳腺癌耐药蛋白ATP结合转运蛋白G超家族成员2中的至少一种的抗体。