[发明专利]一种葡萄霜霉病菌的快速分子检测方法与应用

摘要

本发明属于作物病害诊断与防治技术领域，具体涉及一种葡萄霜霉菌的分子检测方法及应用。本发明根据已公开的多种霜霉目真菌和其他常见的植物病原真菌的ITS序列信息，通过生物信息分析，自行设计了一组LAMP引物，结合葡萄霜霉病菌的基因组DNA快速提取技术，采用一步LAMP反应，仅需55min即可从不同葡萄种植区不同品种的葡萄霜霉病样中快速检测出33fg/μL水平葡萄霜霉病菌基因组DNA的存在。本发明特异性强、灵敏度高、检测准确率高、适用范围广，可作为葡萄霜霉病菌的快速检测技术在各地推广应用。

主权项

一种葡萄霜霉病菌的快速检测方法，其特征在于由以下步骤构成：(1)五条葡萄霜霉病菌的特异性LAMP引物，序列分别为：FIP：5’‑GAAGCCAACCATACCGCAAATCGGCGACCAATTTATTTGCTGTTG‑3’；BIP：5’‑GAATCGGTGAACCGTAGCTATATGTAAGCTGCCACTCTACTTCG‑3’；F3：5’‑GTTTGTCTATTGTGGCCAGTC‑3’；B3：5’‑CCAAATGGATCGACCCTCG‑3’；LB：5’‑GACTATGCTTTCAATCAGTTT‑3’；(2)葡萄霜霉病菌的快速分子检测体系的建立，其步骤包括：1)从被测样品材料中抽提葡萄霜霉病菌基因组DNA；2)LAMP扩增反应体系25μL：包含2.5μL10×ThermoPol Reaction buffer，8mM MgCl2，1.4mM dNTP，1M Betain，1.4μM内引物FIP和BIP，0.2μM外引物F3和B3，1.4uM LB环引物，8U Bst DNA聚合酶大片段，1μL模板DNA，ddH2O3.4μL；反应程序：65℃恒温反应30min；3)产物检测：反应完成后，取出PCR管，对着光用肉眼观察浊度或400nm光下使用浊度仪检测浊度就能判定结果，或者取5μL LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离130V30min，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据梯形条带的有无判定结果，或向PCR管内加入2μL 1000×SYBRGreenI染料后于紫外灯下根据绿色荧光的有无判定结果。