[发明专利]一种霉菌融合子用于添加中药制曲的方法

摘要

本发明涉及一种霉菌融合子构建及其用于添加中药制曲的方法，属于轻工生物技术领域。该方法是利用白曲霉产糖化酶和绿色木霉产纤维素酶能力的差异，利用非对称灭活亲本及原生质体融合方式，使双亲本原生质体融合得融合子，将该融合子用于添加中药制曲，得到同时具有糖化酶活力、纤维素酶活力和中药活性成分的中曲药。该方法包括菌丝体的培养与预处理、原生质体的制备、原生质体非对称灭活、融合子构建、融合子筛选、中药制曲等工艺步骤。本发明方法操作简单，过程易于实现，得到的融合子中药曲对后续的酿造原材料中纤维素成分的利用及产品保健功能的获得具有重要的意义。

主权项

一种霉菌融合子的构建及其用于添加到中药制曲的方法，其特征在于依次包括以下工艺步骤：（1）菌丝体的培养及预处理将两亲本白曲霉与绿色木霉分别转接于培养基上，待其生长30~48小时后，用无菌水制成107~109个/ml霉菌孢子菌悬液；在无菌条件下将300μL霉菌孢子菌悬液接种于液体培养基中，于温度30~32℃，转数100~120rpm的气浴摇床中振荡培养18~24小时，得菌丝球培养液；将菌丝球培养液经无菌擦镜纸抽滤、无菌水漂洗去除培养基；再用0.9mol/L的氯化钠渗稳剂在离心机中离心洗涤3次，每次5分钟，即得预处理后的湿菌丝体；（2）原生质体的制备①将步骤（1）预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，白曲霉按0.5~1.0g/10ml的量加入复合酶液，于温度30~32℃、转数80~100rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解2~3小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于2500~3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集白曲霉原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得白曲霉原生质体悬浮液；②将步骤（1）预处理后的湿菌丝体称取0.5g置于50ml实验瓶中，绿色木霉按1.0~1.5g/10ml的量加入复合酶液，于温度30~35℃、转数80~100rpm恒温气浴条件下进行酶解，酶解3~5小时后用无菌擦镜纸过滤，滤液于2500~3000rpm离心10分钟，之后用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟，收集绿色木霉原生质体并悬于渗稳剂溶液中，得绿色木霉原生质体悬浮液；（3）原生质体非对称灭活：①白曲霉热灭活取步骤（2）中①白曲霉原生质体悬浮液1ml于EP管中，在60~65℃恒温水浴中灭活20~30分钟，然后立即放入冰浴中完全冷却；②绿色木霉紫外灭活取步骤（2）中②绿色木霉原生质体悬浮液5ml置于带磁力搅拌子的培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌台上，于紫外灯下照射；（4）融合子构建：将两亲本灭活后的原生质体悬浮液在离心管中等量混合，然后加入配比为30~50%的聚乙二醇，0.01mol/L的氯化钙和0.7~0.9mol/L氯化钠融合剂，混匀后放入恒温培养箱中于30~32℃培养30~40分钟，取出融合后原生质体悬浮液放入冷冻离心机中，用渗稳剂离心洗涤3次，每次5分钟；将洗涤完成的原生质体重悬于0.7~0.9mol/L的氯化钠渗稳剂中，得到融合后的原生质体；（5）融合子的筛选：①融合子初筛将融合完成后的悬浮液稀释后涂布于淀粉再生平板中，于30~32℃培养1~3天，中间每隔12小时观察一次，挑选出透明圈大的融合子菌株用平板划线分离法纯化，再将分离纯化后的融合子菌株接种于羧甲基纤维素钠培养基上，于30~32℃培养2~3天，挑选出能够生长的融合子；②融合子复筛挑选多株上述初筛的融合子接种于羧甲基纤维素钠液体培养基上，其中羧甲基纤维素钠用淀粉取代，无菌条件下于30~32℃培养2~3天后加入碘液，挑选出淀粉利用情况好的融合子，再将其接入无机盐液体培养基中，加入无菌滤纸条，于30~32℃培养5~8天，再挑选出既能利用淀粉又能降解滤纸条的融合子，进行传代培养；（6）融合子用于添加中药制曲：将步骤（5）中得到传代稳定的融合子进行扩大培养，再制成浓度为107~108个/ml的融合子孢子悬浮液；制曲所用中药粉碎后过40目筛子；制曲大米经除杂、淘洗后蒸煮40分钟，将其摊凉后接入2~3%（v/w）融合子孢子悬浮液和添加量为0.5~1%（w/w）的中药粉，在无菌条件下使中药粉和融合子孢子悬浮液均匀分布于蒸米中；将蒸米堆积并加盖八层纱布，在温度36~38℃、湿度90~95%的条件下培养36~48小时，期间每隔12小时翻曲一次，再在温度30~32℃、湿度90~95%条件下堆积培养24~36小时，培养完成后将中药曲摊平，在温度40℃、湿度50%条件下干燥15小时，即制得融合子中药曲。