[发明专利]稳定表达临床拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株的构建方法

摘要

本发明公开了稳定表达拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒的细胞株的构建方法，通过细胞分子生物学技术使HBV全基因整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞基因组中，产生病毒的自主复制和完整的生命周期循环。本发明所构建的细胞株能够支持HBV DNA的高水平复制及抗原的稳定表达，对拉米夫定具有高度耐药性，适用于HBV生物学特性、耐药机理及新型抗病毒药物的体外筛选研究。

主权项

拉米夫定耐药性乙型肝炎病毒细胞株的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)引物的设计与合成：合成如下表所示的引物，P1、P2为扩增HBV全基因上下游引物；A1、A2为扩增A片段的上下游引物，B1、B2为扩增B片段的上下游引物，C1、C2为扩增C片段的上下游引物，D1、D2为扩增D片段的上下游引物；(2)PCR扩增：以含rtL180M+rtM204V双重变异HBV基因组的T‑HBV为模板，应用相应引物，通过PCR技术扩增A、B、C、D基因片段；进一步以A、B、C、D基因片段为模板，应用相应引物，通过重组PCR技术扩增A+B与C+D基因片段；(3)1.3倍HBV全基因的定向克隆将pcDNA3.1(+)质粒经Hind III和Not I双酶切，将A+B基因片段和C+D基因片段分别用Hind III、EcoR I和EcoR I、Not I双酶切，然后应用三片段连接法将A+B、C+D基因片段定向克隆至pcDNA3.1(+)载体，获得含有1.3倍HBV全基因的真核表达载体pcDNA3.1‑1.3HBV；(4)细胞转染与抗性筛选：采用脂质体转染方式将无内毒素的含rtL180M+rtM204V双重变异株的真核表达质粒pcDNA3.1‑1.3HBV转染人肝癌细胞株HepG2细胞；转染后，将转染细胞以1∶10的比例传代至新的培养板；24h后，更换含590‑610μg/ml G418的DMEM筛选培养液进行抗性筛选，每3至4天更换一次筛选培养液，直至培养孔中出现单细胞克隆；然后将单细胞克隆转移至培养瓶，加入筛选培养液进一步扩大培养。细胞长满培养瓶后改用半数筛选浓度的G418(290‑310μg/ml)作为维持浓度传代培养，细胞株命名为HepG2.RL1，每2‑3天传代一次。