[发明专利]利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法

摘要

本发明公开一种利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs的方法，应用地高辛标记系统，灵敏度比传统地高辛标记Northern blots检测系统至少高50倍，与放射性同位素标记Northern blots检测系统相当；对环境不会造成污染，非常安全，同时无需杂交步骤，能在9-10h之内完成，方便快速，检测成本较低。解决了当前检测方法安全性不高、程序复杂、价格昂贵、灵敏度低等问题。

主权项

一种利用地高辛标记EDC交联桥连法检测miRNAs方法，包括以下步骤：1)  样本细胞总RNA的提取用Trizol提取样本细胞总RNA；2) miRNA的捕获与连接首先进行miRNA的捕获，体系为：7μl RNA+ddH2O，1μl 1pmol/μl Bridge，1μl 10×Capture buffer,1μl 1pmol/μl 3’DIG‑probe,混匀，在PCR仪中进行如下程序：94℃，1min；65℃，2min；37℃，10min；然后向上述反应中加T4 DNA连接酶混合物进行连接，体系为：1μl T4 DNA连接酶，1.5μl 10×T4 buffer，2.5μl  ddH2O；在30℃下反应1h，该反应产物为最终加样样品； 3) 含8M尿素的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳(1) 按照以下比例配制含有8M尿素的15%PAGE胶：3.75ml 40% acrylamidel，1ml 5×TBE，4.2g Urea，45μl 10%APS，10μl TEMED，最后加水补至10ml，混匀后灌胶；(2) 样品准备：将上一步中的样品等量与RNA loading buffer混匀；(3) 变性：均匀混合样品，95℃变性3分钟后，立即冰上放置；(4) 预电泳：正确安装电泳装置，倒入0.5×TBE电泳缓冲液，用注射器吹打电泳孔的残胶，120V，预电泳20分钟；(5) 点样：预电泳后再次用注射器吹打电泳孔，点样；(6) 恒压电泳：120V电泳约2.5小时，溴酚兰跑到胶底部；4) 转膜按照胶的面积，裁剪同样大小的带正电荷的尼龙膜和WATMAN滤纸，做成三明治状，用半干转移仪转膜，转膜30分钟；5)   EDC交联：转膜后将膜取出，放在浸有EDC交联试剂的WATMAN滤纸上，60℃作用1‑2h；6) 封闭把膜放入1% Blocking buffer中，室温封闭0.5小时；7) 加抗体   加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体于1% Blocking中（1：15000），室温孵育0.5小时；8) 洗涤Washing buffer(Maleic Acid Buffer(pH7.5),0.3% Tween 20(v/v) )洗膜2次，每次15分钟；Detecting buffer（Detecting buffer：6.055gTris和2.9gNaCl加入480ml水中，用浓盐酸调至PH 9.5，定容到500ml）洗膜1次，每次5分钟；9)显影(1) 膜正面放上适量CDP‑Star ready‑to‑use试剂，确保膜上全部铺满，室温孵育5分钟后挤掉试剂，用滤纸吸干残液，放入暗盒中用X光片曝光；(2) 将X光片从暗盒中取出，放入D76显影液中1‑2分钟，放入自来水中停影，然后放入定影液中定影15分钟，最后水洗晾干。