[发明专利]一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法

摘要

本发明公开一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法。传统的检测方法检测时间长，耗时、耗力。本发明根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2。取样加水均质，制成组织匀浆样品；组织匀浆样品中提取DNA；PCR扩增，将扩增产物与6×LoadingBuffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。本发明根据五种肉类基因的同源性设计了6条引物，与传统方法比较，引物数量大为减少，从而减少了假阳性的出现；同时确认了该方法可以检测出0.1ng的DNA含量。

主权项

一种鉴别掺假肉及其制品的多重PCR快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：根据狐狸肉、老鼠肉、猪肉、鸡肉、鸭肉作为特征靶基因分别设计5对特异性引物：F1/R1、F2/R1、F3/R1、F4/R2、F4/R2 ，即6条特异性引物：F1、F2、F3、F4、R1、R2；步骤(1).样品前处理：将肉类及其制品取样，加入10倍肉类及其制品体积的灭菌蒸馏水中，用组织匀浆机均质1min，制成组织匀浆样品；步骤(2).样品DNA提取：将50 mg组织匀浆样品、200 µl pH值为8.0的 TE缓冲液涡旋混匀，加入400 µl裂解液，混匀，然后加入600 µl的第一混合溶剂剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与该上清液等体积的第二混合溶剂，剧烈振荡，12000 g离心10min，取上清液加入与该上清液等体积氯仿，剧烈振荡，12000g离心10 min，取上清液加入与0.8倍该上清液体积的异丙醇，12000g离心l0 min，得到沉淀物，用70﹪乙醇清洗沉淀物1次，在常温或50℃下，20min晾干，然后加入80 µl pH值为8.0的 TE缓冲液，使沉淀物溶解于TE缓冲液，得到DNA提取物；该DNA提取物即为模板DNA；将DNA提取物采用核酸蛋白检测仪测定模板DNA的浓度与纯度；所述的TE缓冲液为1 ml 浓度为1 M 、pH值为 8.0的Tris‑Cl，0.2 ml浓度为 0.5 M、pH值为 8.0的EDTA，定容至100 ml溶液；         所述的裂解液为Tris‑HCl、乙二胺四乙酸EDTA、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸钠SDS组成的混合液，其中Tris‑HCl的浓度为50 mM、 pH值为 8.0，乙二胺四乙酸EDTA的浓度为25 mM，NaCl的浓度为100 mM，蛋白酶K的浓度为20 µg/µL，十二烷基硫酸钠SDS的质量分数为10﹪；所述的第一混合溶剂为酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中酚、氯仿与异戊醇的体积比为25：24：1；所述的第二混合溶剂为氯仿、异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；步骤(3).多重PCR扩增：将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行PCR扩增,得到扩增产物；所述的PCR扩增反应体系为50 µl由5.0 µl的10×PCR Buffer、0.5 µl浓度为2.5 U/µl 的Taq DNA 聚合酶、4.0 µl浓度为2.5 mmol/L的 dNTPs、6.5 µl加人混合引物、2.0 µl模板DNA和余量的灭菌蒸馏水组成；所述的多重PCR扩增反应的条件是94℃预变性5min；94℃ 变性30s，55℃ 退火30s，72℃ 延伸30s，35个循环；72℃延伸7min；所述的加人混合引物为5对特异性引物的混合引物，其中5对特异性引物的浓度比为F1:F2:F3:F4:R1:R2=1:1:1:2:3:2；步骤(4).扩增产物电泳检测：PCR扩增反应结束后，将5µl 扩增产物与1µl 6×Loading Buffer混合，用2﹪琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶成像系统成像得到相应的电泳条带判断结果。